目前，科研人员已表征超100种独特的RNA修饰，包括腺苷到肌苷（A-to-I）编辑、假尿嘧啶修饰等；其中，非编码RNA（ncRNAs）是这些修饰的常见靶点，对人类健康和疾病具有重要意义。Nanopore平台的直接RNA-seq方法在RNA修饰检测分析方面具有潜力，但其在文库制备过程中使用poly(A)选择的标准直接RNA-seq方法，这限制了对许多不同类型ncRNA的捕获。
近日，加拿大曼尼托巴大学的科研团队在Genome Biology发表了题为”NERD-seq: a novel approach of Nanopore direct RNA sequencing that expands representation of non-coding RNAs”的文章。研究团队提出了一种名为NERD-seq的方法，扩展了标准直接RNA-seq的应用范围，能够在全基因组范围内检测多种ncRNA类型，同时保持了对高复杂性mRNA转录组的测序能力。使用神经组织作为验证，该研究证明NERD-seq技术扩展了频繁修饰ncRNA的表征，包括snoRNA、snRNA、scRNA、srpRNA、tRNA和rRF等。综上，NERD-seq能够同时研究脑组织及其他组织中的mRNA和ncRNA表观转录组。
标准的直接RNA-seq方法依赖于poly(A)选择，可对poly(A)转录组（主要是mRNA）进行测序，但无法有效检测没有poly(A)尾的短ncRNA。为改善这一局限性，同时保持对poly(A)转录组进行测序的能力，研究团队开发了一种名为NERD-seq的非编码富集RNA直接测序方法（图1）。
该方法利用柱基大小富集将总RNA分为长RNA和短RNA两部分，短RNA部分通过poly(A)聚合酶添加poly(A)尾部，使其能够与poly(T)测序接头蛋白形成碱基配对，从而提高短RNA纳米孔测序的准确性；长RNA部分则保留全长rRNA，避免多聚腺苷酸化；在灭活poly(A)聚合酶后，将两个部分（短和长RNA）再次聚集在一起。
此外，为克服高度结构化RNA区域在测序过程中的阻碍，研究团队使用GspSSD 2.0 DNA聚合酶改进了互补链的合成。经验证，NERD-seq能够同时富集短ncRNA、mRNA和长ncRNA，而不会产生显著的poly(A)长度偏差。
图1.NERD-seq方法概述
为评估NERD-seq的潜力，研究团队利用从小鼠海马体提取的总RNA，对NERD-seq和标准直接RNA-seq测序结果进行了比较（图2）。结果显示，与标准直接RNA-seq方法相比，NERD-seq能够有效富集较短的非poly(A)RNA，可提供更多的信息，证明了该方法在神经组织RNA测序中的应用潜力。
研究团队通过NERD-seq技术对基因组元件进行了测序reads分析，发现与标准直接RNA-seq方法相比，NERD-seq在编码区和非编码区的reads分布有显著差异。标准直接RNA-seq主要关注编码区，尤其是已知外显子；而NERD-seq能够生成更多、具有更高覆盖度的非编码区reads。与标准方法相比，LINE是NERD-seq中代表性过剩的主要非编码元件之一。
图2.NERD-seq能够为非编码基因组生成具有更高覆盖率的reads
除生成覆盖度更高的非编码基因组reads外，NERD-seq还能有效检测mRNA和poly(A) ncRNA。经验证，NERD-seq能够检测到转录起始位点（TSS）下游reads分布中峰值所记录的mRNA；在小鼠中NERD-seq成功检测到由SINE元件B2产生的全长poly(A) ncRNA（B2 RNA），并在人类大脑皮层组织中检测到丰富的、与人类B2 RNA同源的Alu SINE RNA。特别地，NERD-seq还能像标准方法一样分析mRNA的剪接模式。
图3.NERD-seq可以可靠地检测mRNA
综上，NERD-seq技术在检测poly(A) ncRNA和分析mRNA剪接模式方面显示出与标准方法相似的性能，可有效检测到poly(A)转录物及其亚型。
为评估NERD-seq能否检测已知类型的非poly(A) ncRNA，研究团队生成了四类ncRNA（snoRNA、snRNA、scRNAs和srpRNA）的TSS周围相对reads密度分布图，并与标准方法和外部直接RNA-seq数据进行比较（图4）。结果显示，只有NERD-seq为所有四个类型ncRNA生成了稳健的分布。
图4.NERD-seq可检测snoRNA、snRNA、scRNA 和srpRNA
研究团队还评估了NERD-seq对另一种重要的非poly(A)ncRNA——tRNA的检测性能。结果显示，NERD-seq能够在tRNA的TSS周围产生稳健的分布，其检测到的tRNA数量远超标准RNA检测方法；并能够产生与宏基因组数据类似的谱图。上述结果表明，NERD-seq可有效扩展直接RNA-seq功能，检测到标准RNA-seq可能遗漏或测序数量不足的多类短非poly(A)ncRNA。
来自LINE的ncRNA在预防神经退行性疾病中具有重要作用，研究团队将通过NERD-seq和标准方法产生的reads映射到LINE元基因上，以识别LINE元件中的热点。与标准文库相比，NERD-seq数据中映射到LINE元件的reads更加丰富；在NERD-seq检测到的所有主要LINE元件中，来自LINE L1家族的reads覆盖率最高。这些结果表明，NERD-seq技术能够检测到源自LINE元件内部的ncRNA，并能从测序reads中提取更多无法通过标准方法获得的信息。
图5.NERD-seq检测LINE L1相关的ncRNA
为评估NERD-seq生成的数据在检测RNA修饰方面的有效性，研究团队使用来自合成构建体的人类7SK基因进行体外转录（IVT），并将其与通过标准和NERD-seq方法从人类大脑皮层（5个供体）测序的总RNA进行比较。与标准测序方法相比，NERD-seq无需使用独特的adapter便能捕获更多的7SK reads 以及其他多种RNA分子。
此外，研究团队还观察了GRCh38参考基因组中的rn7SK基因组区域，确认了尿嘧啶250处的假尿苷位点存在强烈的T/C错配；并发现了可能的肌苷位点和APOBEC底物相关的错配位点。
上述结果表明，NERD-seq方案在分析RNA修饰和表观转录组特征方面具有潜在的优势，在不需要特殊adapter 的情况下能够捕获更多的RNA分子。
图6. NERD-seq可检测7SK RNA中的RNA修饰
综上所述，研究团队提出了一种名为NERD-seq的非编码RNA直接测序方法，该方法改进了标准的直接RNA测序文库技术，能够同时富集和捕获多种类型的ncRNA和mRNA。通过量化重要ncRNA类型的相对富集，研究团队证明了NERD-seq的效用，并评估了snRNA的表观转录组标记。总的来说，NERD-seq能够促进许多重要的ncRNAs相关研究，将其与mRNA的标准分析相结合可使转录组和表观转录组分析更加全面。
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