ProteinGym数据集（v1.0.0）包含来自各种生物体的217个深度突变扫描替代实验，以及来自62种方法的理论预测；其中包括28个病毒实验，涉及多个点突变和单点突变。相关性分析显示，GEMME和TranseptEVE家族模型在病毒蛋白突变效应预测方面表现最佳。此外，研究团队还评估了最近开发的ESCOTT和iGEMME方法的性能。结果显示，无论是预测组合突变（单点突变+多点突变）还是仅预测单点突变，ESCOTT方法的表现均是最佳，而iGEMME则是次佳方法。与TranceptEVE相比，ESCOTT和iGEMME的计算速度更快，且可以在CPU上运行。

研究团队使用2024年7月测序的MPXV最新菌株，生成了包含175种蛋白质的fasta文件；OPG003、OPG025、OPG108和OPG147等蛋白质的基因未知片段较长被剔除，最终剩余171种蛋白质。接下来，研究团队使用Colabfold v1.5.5生成了MSA文件和蛋白质结构。ESCOTT和iGEMME都需要MSA文件作为输入；iGEMME仅使用MSA文件的进化信息来确定突变的影响，而 ESCOTT可同时使用进化信息和来自PDB格式文件结构信息。

预测结构的质量可能会影响突变景观计算。为此，研究团队通过可用的实验结构（A42R profilin-like蛋白等）对预测结构进行质量评估，发现预测效果良好。pLDDT是检查预测结构质量的另一个指标，研究团队收集了171种蛋白质中所有氨基酸的pLDDT，其中有75.5%的pLDDT值非常高或很高（图2 C）。结构中的螺旋（coil）是蛋白质紊乱的指标，研究团队还分析了所有氨基酸的二级结构，发现coil仅占24.9%。

现有的实验结构、pLDDT值和二级结构分析表明，预测结构的质量良好，可用于预测MPXV基因组编码的所有蛋白质的突变效应。

研究团队用ESCOTT和iGEMME方法计算了171种MPXV蛋白的单点突变图谱，分别获得了171个和169种蛋白质的完整突变图谱；使用PRESCOTT程序计算了171个基因的所有单点氨基酸突变的原始ESCOTT和iGEMME分数，并对其进行排序，进一步获得ESCOTT和iGEMME排序分数。

如下示例为其中的一个输出，研究团队展示了病毒核心半胱氨酸蛋白酶（其主要作用是降解肽或蛋白质）所有可能氨基酸突变的排序影响。结果显示，该蛋白质的iGEMME分数（排序、原始）与ESCOTT分数（排序、原始）相似。对ESCOTT和iGEMME图形的视觉检查显示，这两种方法的结果在蛋白酶上非常相似，为此，研究团队计算了169种蛋白质ESCOTT评分和iGEMME评分之间的Spearman相关性，发现两种方法具有较高的相似性和一致性。

除完整的突变图谱外，研究团队还计算了每个位置的平均最小突变评分（AMMS），将其添加到PDB文件中占位列中。在许多病毒蛋白酶中，存在一个催化二元体（或三元体），其功能类似于化学剪刀。该蛋白酶的催化二元体为H241和C328；从图3B、3C可以清楚地看出，催化二元氨基酸是对突变最敏感的位置。

研究团队使用ESCOTT结果计算了171种蛋白质的AGMS，并筛选出得分最高的20个基因（图4）。前20种蛋白质中有6种位于病毒膜上，这构成了病毒与宿主蛋白质相互作用的前沿。排在前20位的第一个基因为OPG076，可编码成熟病毒膜融合复合物成分，能显著影响病毒感染力及膜融合能力；第二个基因是OPG059，其编码的细胞色素C氧化酶在病毒复制中发挥作用；第三个OPG158基因编码一种与疫苗病毒A32蛋白类似的蛋白质——A32.5L，参与病毒膜的组装。

有趣的是，图4中还出现了一种假想的蛋白质（OPG166），这种蛋白质可能会是一种新的药物靶点。上述结果表明，前20名中的许多蛋白质在病毒中起着重要作用，该研究的分析可能会揭示一些未被考虑的新靶蛋白。

综上所述，研究团队使用最先进的突变效应预测方法ESCOTT和iGEMME方法计算了171个MPXV基因的完整单点突变图谱；ESCOTT/iGEMME突变图谱可用于评估新MPXV蛋白变体的潜在影响。此外，该研究还引入了一种新指标AGMS，具有高AGMS值的蛋白质可作为潜在的药物/疫苗靶标，可显著促进对于药物和疫苗设计研究。这项开创性研究强调了当前全球卫生危机背景下理解MPXV演变的重要性，并提供了一个强大的计算框架。