近日，哈尔滨工业大学任玉坤教授、陶冶副教授团队联合哈尔滨医科大学附属第一医院周海舟教授团队提出了一种紧凑的高灵敏度光热逆转录酶环介导的等温扩增（RT-LAMP）芯片（SPRC），旨在检测多种疾病。芯片上的核酸扩增是通过LED照明或简单的阳光聚焦驱动的LAMP来实现。研究显示，SPRC可在芯片的有限空间内同时进行样本添加和扩增，并在样本添加过程中自主富集核酸（约350x），实现了低至0.2拷贝/μL的检测限（LOD），检测时间仅30分钟。SPRC提供了经济和高灵敏度识别多种疾病的能力，每次反应检测成本约为1.62美元。利用120个临床样本进行验证，SPRC的准确率达到95%，特异性超过97.5%。总的来说，SPRC能够利用光能同时检测多种疾病，在POCT方面取得了可喜的进展。
研究团队利用光学、化学、生物学和热力学原理开发了芯片SPRC。图1A显示了SPRC的结构。导流层用于将溶液从加载槽均匀分布到每个反应室，从而实现多路检测。过滤层由两种不同类型的滤纸和石蜡颗粒组成，主要用于过滤溶液中的杂质和捕获核酸。手动旋转加载槽将富含核酸的滤纸直接移动到各自的反应室上方，通过底部加热进行片上洗脱和扩增。每个反应室可单独加热，提高了加热效率，避免了资源浪费。
当光子照射Au膜表面时，激发局部表面等离子体共振，同时将膜表面电子提升到高能状态，从而产生热电子，最终实现均匀的热分布。整个转变通常在飞秒内完成。图1B显示了由LED和太阳光驱动的光热转换过程。SPRC的工作原理如图1C所示。核酸的预富集是在加载样本时完成的，然后进行片上核酸洗脱和LAMP。最后，用荧光法检测扩增产物。为了提高SPRC的可操作性，研究人员开发了一种紧凑的装置（图1D），它可以自动提取、放大和检测核酸，只需要将裂解的样本转移到加载槽。与传统LAMP相比，SPRC可以实现约350倍的预浓缩，即使对于低浓度的样本，也可以在30分钟内获得准确的检测结果（图1E）。
图1.SPRC的结构和工作原理。
考虑到光源、Au膜对加热性能的影响，经过多次试验，发现波长为465nm的蓝色LED作为SPRC的光源对Au薄膜的加热效果最好（图2A、B），Au薄膜尺寸为厚度120nm，L = 8mm和S = 20μm时光热转换效果最好（图2C）。同时，研究团队还改进了过滤，可以在1 nm的浓度下捕获多达1mL的核酸，这足以用于各种临床样本（图2E-H）。
图2. Au膜光热分析与滤纸改进。
考虑不同孔径下的流速和DNA捕获效率，研究团队选择了3μm的PES膜进行上层过滤（图3左）。为了实现多重检测，研究人员评估了流入每个反应室的样本溶液的均匀性，发现流向四个吸水片的溶液体积基本一致，60s内的偏差保持在10%以内，这可以保证每张滤纸吸附相同数量的核酸，有利于多重检测。
在各种条件下，λ DNA（48,000bp）的SPRC LOD为0.2拷贝/μL，乙肝DNA （3200 bp）和丙肝RNA（9600 bp）的SPRC LOD为0.46拷贝/μL（图3右）。此外，在长达4周的时间里，SPRC的性能没有明显变化（图4F）。
图3.SPRC的性能
为了评估SPRC的临床适用性，研究团队对乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、甲型流感病毒（IAV）和艾滋病毒（HIV）进行了检测。对于每种疾病，采集80名志愿者的静脉血（图4A）。以HBV和HCV质控样本为例，SPRC在35组对照实验中均表现出良好的重复性（图4B）。
每个样本分别使用SPRC或台式PCR系统，使用相同的试剂和引物进行检测（图4C）。在检测的80个样本中，SPRC成功检测了76个（95%）。在准确检测的样本中，阳性样本的荧光强度明显高于阴性样本（图4D）。除HIV外，所有疾病的ROC曲线下面积均为1（图4F）。
将SPRC结果与哈尔滨医科大学第一附属医院医用PCR检测系统进行比较，发现使用人工离心装置和光热芯片完全取代了复杂的仪器进行样本处理，而不影响检测结果。
图4.用SPRC检测血清样本用于各种疾病的诊断。
研究团队收集了20名腺病毒（ADV）患者和20名COVID-19患者的鼻咽拭子，并使用额外的过滤器对样本进行预过滤，以去除较大的颗粒杂质。对于腺病毒，20个阳性样本和20个阴性样本均被SPRC检测到，所有阳性样本的荧光强度均显著高于其他样本（图5B）。对于SARS-CoV-2，SPRC可靠地检测到20例COVID-19患者中的18例，确定了N、E和O基因（图5D）。ROC曲线显示SPRC的特异性未97.5%，表明SPRC可用于鼻咽拭子检测，证明了SPRC处理多种类型样本的能力。
研究团队还设计了一种便携式太阳能光热应用装置（图5F）。在阳光充足时，该设备可以在25秒内达到65°C。与上述LED驱动检测相比，阳光驱动检测的准确率略低，30个样本中检测到28个（93.33%）（图5G）。该结果表明，即使在LED照明不方便的地区，SPRC仍然可以进行快速核酸检测。
图5.用SPRC检测鼻咽拭子样本。
SPRC集成了多个先进功能，以解决分子诊断中的挑战，特别是在偏远或资源有限的环境中，提供了几个优势：（i）在样本添加过程中同时完成高效富集NAs（约350×）和试剂等分。芯片上NAs的洗脱和扩增是通过LED照射或简单的太阳光聚焦驱动的光热转换来实现的，从而为偏远地区提供了合适的解决方案。（ii）每个反应的检测成本约为1.62美元，λDNA的LOD为0.2拷贝/μL。与传统的RT-PCR方法相比，SPRC在保证检测灵敏度的同时大大降低了成本。（iii）结合紧凑的设备，SPRC可以在30分钟内利用血清同时检测四种疾病，即乙型肝炎、丙型肝炎、甲型流感和艾滋病，诊断准确率为95%，特异性为98.75%，LOD为0.46拷贝/μL，实现低成本、高灵敏度的疾病检测，传统的RT-PCR方法需要2小时左右。因此，SPRC可以实现急诊手术或快速输血前的传染病筛查。（iv）SPRC也可用于检测鼻咽拭子样本，诊断准确率为95%，特异性为97.5%。
对80份静脉血样本的临床检测表明，SPRC与标准RT-PCR具有良好的一致性。除血清样本外，SPRC还可对全血和鼻咽拭子进行检测，展示了出色的多类型样本处理能力。SPRC将样本处理、洗脱、扩增和检测过程整合为一步，在保持高灵敏度的同时进行多种病原体的同时检测。与其他检测方法相比，SPRC不需要样本提取或纯化步骤，只需简单的加热裂解，因此不需要专业的操作人员和复杂的仪器。
论文原文：
Compact highly sensitive photothermal RT-LAMP chip for simultaneous multidisease detection. SCIENCE ADVANCES, 2024, DOI: 10.1126/sciadv.adq2899
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adq2899
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