全脑范围内分子的三维成像对于理解细胞的空间关系及其参与的回路至关重要。目前，虽然已经发表了多种组织清除方案用于成像，但其中绝大多数侧重于评估蛋白质的分布，而不是RNA转录本。尽管一些新开发的技术试图将RNA成像与组织清除结合起来，但将其应用于更大的组织或器官，如整个哺乳动物的大脑，仍然具有挑战性。
2020年6月，瑞典卡罗林斯卡学院的研究团队在Nature Biomedical Engineering发文报道了新开发的原位免疫荧光标记清除肿瘤样本诊断技术DIIFCO，该技术结合原位杂交链式反应HCR（isHCR）和有机溶剂清除技术，可用于研究小鼠胚胎、大脑切片和临床活检组织中的RNA，但是这种方法在完整的大脑中可视化RNA仍不可行。
近日，该团队在国际顶尖期刊Science发表了题为“Whole-brain spatial transcriptional analysis at cellular resolution”的文章，报道了新开发的一种技术TRISCO——Tris缓冲液介导的清除器官中isHCR信号的保留（Tris buffer--mediated retention of in situ hybridization chain reaction signal in cleared organs），TRISCO可以对经有机溶剂清除后具有均匀isHCR信号和高组织透明度的整个大脑进行空间RNA分析。因此，TRISCO提供了一种简单方法来实现单细胞分辨率的全脑三维成像，对整个大脑进行全面的转录空间分析，揭示整个大脑的转录图谱。该研究也被选为当期的封面文章。
文章发表在Science
01TRISCO可以实现单细胞分辨率的全脑RNA成像
现有的组织RNA成像技术仅限于超薄切片或只有几毫米厚的样本，如果处理较厚样本，则会出现探针穿透不均匀、RNA完整性受损、信号强度低以及清除程序后组织透明度降低等问题。为了实现全脑成像，研究人员首先优化了流程和处理策略。例如，为了保护RNA的完整性，研究人员直接将样本从100%甲醇转移到50%甲酰胺，甲酰胺已被证明可以抑制核糖核酸酶（RNase）活性，并使用了聚乙烯磺酸（PVSA）（一种具有成本效益的RNase抑制剂），且PVSA不影响isHCR的RNA标记。此外，研究发现，在清理过程之前用水冲洗大脑样本可以显著提高组织的透明度，后续也探索了在组织清除后维持isHCR标记的荧光模式的策略。在测试了几种缓冲液后，研究发现Tris有效地保留了isHCR信号，同时也确保了有效的组织清除。
图1. 实验方案和处理步骤的优化
在建立并完善了实验方案的所有步骤后，研究团队使用完整的TRISCO技术流程对整个小鼠大脑进行了三维成像：多聚甲醛固定、脱皮、漂白、阻断、杂交、洗涤、特定温度下的探针孵育、Tris-HCI清洗和有机溶剂清除。在8周龄小鼠的全脑中，结合DiYO-1核染色，检测到Pvalb、Gad1和生长抑素（Sst）的RNA。大脑的标志，如新皮层和海马体，都清晰可辨。此外，TRISCO细胞分辨率下显示Pvalb、Gad1和Sst在海马神经元中重叠且存在不同的表达模式。
为了进一步验证TRISCO的多功能性，研究团队还检测了成年小鼠大脑中用于细胞和组织分类的多个基因的表达模式，并定制了针对不同细胞类型表达的基因探针，包括星形胶质细胞的Mfge8和Aldoc，小胶质细胞的Csf1r和Hexb，少突胶质细胞及其前体的Sox10和Pdgfra。结果显示，使用TRISCO可以很容易地检测到上述细胞类型中的典型转录物表达，并通过比较发现TRISCO可以提供对整个区域的无偏检测。此外，研究还分析了RNA转录相关的神经递质在高级脑功能中的表达，包括多巴胺、血清素和乙酰胆碱等，以单细胞分辨率揭示了脑深部结构中特定的基因表达模式和复杂转录模式。
图2. TRISCO对小鼠全脑进行多重染色
02评估跨哺乳动物器官和神经元活动的TRISCO成像
为了扩大TRISCO的潜在用途，研究人员还对啮齿动物和人类的各种组织进行了三维成像。结果发现，TRISCO可以很容易看到大鼠脑中的Th mRNA和豚鼠脑中的Sst mRNA，并显示了单细胞分辨率下Th mRNA和Sst mRNA的特征表达模式。此外，研究还对人胎儿大脑半球（受孕后12.5周）进行了TBR2 mRNA染色，并成功检测到人类胎儿大脑深处明确的空间结构。以上结果表明，TRISCO是分析大体积组织的高度稳健工具。
为了评估TRISCO检测全脑功能性神经元活动的能力，研究人员评估了早期基因c-Fos在司美格鲁肽治疗（一种临床批准用于治疗2型糖尿病和肥胖症的药物）小鼠中的表达。结果发现，药物处理后，与食欲和体重调节相关区域的c-Fos mRNA表达增强，并利用免疫标记的溶剂清除器官三维成像技术（iDISCO）对这一结果进行了证实。总的来说，这些数据表明，TRISCO是一个强大的工具，可以全面研究全脑和其他器官的细胞身份、RNA表达和活性调节基因的转录等。
图3. 利用TRISCO对啮齿动物全脑及神经元活动进行分析
综上所述，该研究报道的TRISCO为神经科学领域引入了一种强大的新工具。该方法可以对整个大脑中的RNA表达进行三维空间分析。细胞分辨率的全脑成像更是提供了广泛的科学应用，包括转基因动物的表型分析，探索复杂的三维结构，评估活性调节基因转录和进行药物测试等。
图4. Science当期封面，单细胞分辨率下的全脑三维图像
因此，TRISCO的开发标志着高性能成像的实质性进步，其提供的信息在深度和广度上使人们能够更详细和全面地了解完整大脑中的基因表达，为探索大脑的动态和复杂景观奠定了基础。
Kanatani S, Kreutzmann JC, Li Y, et al,. Whole-brain spatial transcriptional analysis at cellular resolution. Science. 2024 Nov 22;386(6724):907-915.
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