现今，下一代测序（NGS）已经在生物医学研究中得到广泛应用，对众多患者产生了深远的影响。利用NGS技术，研究人员可以确定高覆盖度和准确度的致病序列变异体。目前，罕见序列变异在生物医学研究中引起越来越多的关注。到目前为止，在基于NGS的基础研究中，大多数关键的致病变体已确认与某些重要疾病具有相关性，只有更深入地揭示罕见序列变异，才能对疾病的发病原因和进展进行详细研究。此外，在基于NGS的临床应用中，研究人员或医生经常必须处理许多棘手问题，如患病样品可能是高度异质的，这使得实际上以非常低等位基因存在的部分致病变体成为了稀有突变。因此，许多NGS技术的临床应用需要检测超低频率的突变。

近日，Scientific Reports杂志发表了一种新型NGS流程，可从数字化条形码加密单链文库的测序系统中捕获RNA探针靶向的DNA双链体，进而鉴定超低频率突变。

该方法被研究人员称为“DEEPER-Seq”，此方法使用RNA探针靶向两条DNA链，将超灵敏单链库构建与条码纠错相结合。DEEPER-Seq可以从少于20pg的PCR中产生具有PCR错误校正功能的NGS文库，并同时靶向两条DNA链，覆盖率超过98.6％，并能以平均29.2％的比例捕获靶序列。

研究人员在论文中表示，该方法在生物医学和临床应用中对发现新型低频致病变体具有很大的潜力，并且可以为患者确定更多可行的治疗靶点。通过揭示完整的患者基因组谱，包括高频、中频、低频，特别是超低频突变，该方法可以实现前所未有的个性化精准医学水平。研究人员还表示，该方法也可以用于其他临床应用，如血液样本中循环DNA的测序等，在诸多方面具有巨大潜力。 

DEEPER-Library流程

另一方面，单链文库构建在本质上比标准双链文库构建的工作流程更加精确，并且已经被开发用于NGS分析。它将每个DNA单链分子作为文库建设的基本单位，但在该研究之前，还没有单链文库流程能够在单链DNA水平上并入条形码，因此尚未实现纠错。

与传统的双链体测序不同，对于有损伤或非常低量的DNA材料，将DNA单链作为单个分子进行处理并构建NGS文库有着重要意义。在这一技术水平上，每个单链DNA分子可以来自完整的DNA双链体分子，或者单链缺失的DNA双链体分子，甚至一些有轻度损伤的DNA双链体分子。此外，在任何终点修复之前，用唯一的条形码标记每个单链DNA分子，可以消除在末端修复步骤期间人为错误引入DNA序列的任何可能性。这些改进可以促进两个DNA链的高效测序，并独立于其他样品，且能通过每条链上的个体条形码实现极端的纠错能力，同时可以在数据分析中调用具有不同条形码的互补DNA序列，从而进行完美匹配，以进一步确定真实突变。

参考资料：

Targeted sequencing of both DNA strands barcoded and captured individually by RNA probes to identify genome-wide ultra-rare mutations

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41598-017-03448-8