游离DNA的甲基化修饰可以作为生物标志物应用于无创产前检测、癌症早筛早诊、器官移植评估等多个临床领域[1]； 前不久，张鹍教授在Nature Genetics上发表的文章证实，利用甲基化差异信号不但能够检测早期癌症，还能够溯源肿瘤的具体位置[2]；这篇报道如同一剂强心剂，进一步证实了甲基化生物标志物在临床中的价值和应用前景，也将人们对甲基化测序的热情推到了新的高度。那么，对于甲基化测序，如何选择实验方法，实验过程中又会遇到什么样的问题呢？

对于常见的甲基化测序方法，其一是使用甲基化DNA结合蛋白 (MBD) 或是甲基化抗体 (MeDIP) 进行捕获测序，该方法能够获得全基因组范围内100-1000bp分别率的甲基化信号，但无法获得单碱基分辨率的信号；此外，简化基因组甲基化测序 (RRBS) 利用限制性内切酶富集CpG区域，在提高测序性价比的同时，可获得部分基因组 (~10%) 单碱基分辨率的甲基化信号；作为鱼与熊掌兼得的方法，全基因组甲基化测序 (WGBS) 则能得到全基因组范围内单碱基分辨率的甲基化信号。

图1：不同DNA甲基化测序方法参数比较

下面就来重点说说WGBS方法，该方法利用亚硫酸氢盐（Bisulfite, BS）转化达到单碱基分辨率，其应用存在两个问题：1. 建库起始量高（微克级别）；2. 有效数据量低。例如，为了获得30x测序深度，需要高达~230Gb的测序数据量 (按照80%比对率，50%冗余率的数据表现计算)，如果再考虑甲基化测序文库的碱基不均匀性对测序质量的影响，情况可能更糟。样本质量门槛过高将限制该技术的应用，高额的测序费用也是巨大的负担。造成上述问题的根本原因，是让人“又爱又恨”的BS转化技术。

成也BS：1970年，BS转化技术第一次被报道，通过BS处理，将非甲基化的C转化为U，而甲基化状态的C保持不变，通过简单的测序便可对甲基化修饰信号进行检测，极大的简化了研究手段，促进了表观遗传学的发展。BS就像是一个转化器，将“修饰信息”转化为“碱基信息”。

败也BS：BS转化包括变性、脱氨基和脱磺酸基，在这个过程中DNA先被变性成单链，然后它们将遭遇高温、高盐、酸性、碱性环境，如过山车般遭受冰火两重天，最终状态好似经历千万年岁月洗礼的古DNA：单双链混合、出现缺刻、缺口损伤、含有dU核苷酸等。

传统WGBS文库构建流程中，BS转化过程导致~90%的DNA模板丢失,是造成建库起始量高，有效数据量低的 “罪魁祸首”[4]。那么，如何用好BS这套“七伤拳”呢？

图2：亚硫酸氢盐处理导致DNA损伤示意图[3]

改善BS文库构建效率的一种办法是先进行BS转化再构建文库（Post-Bisulfite Construction, PBC），这种策略能够有效的规避BS处理对预文库的损伤，提高模板利用率，降低建库起始量，同时提高测序文库丰富度，增加有效测序数据 (5)。经Bisulfite处理后，DNA以单链和双链的混合状态存在，传统双链连接接头的建库方法不再适用。

图3：转化后建库优势示意图

接下来，再来说说PBC建库方法：

1. 随机引物扩增法

与传统RNA-seq、WGA方法类似，此方法利用一段随机序列合成一链 (随机序列的5’端具有单分子标记序列、接头序列等)，然后利用含另一侧接头序列的随机引物进行二链合成，再通过PCR引入完整的测序接头得到测序文库 [5]。此方法的优势是操作简单，建库周期短，与任何基于随机引物建库的方法一样，如何控制扩增偏好是建库的关键。

2. 单链连接法

开发此方法的初衷是对高度降解的DNA进行文库构建[6]，如古DNA、FFPE样本等；所以，单链连接法也适用于PBC文库构建。先将DNA变性为单链，去磷酸化防止单链DNA串连，再与单链接头连接，利用与单链接头互补的引物进行二链合成，并连接另一侧接头，经PCR扩增引入完整的测序接头序列并同时完成文库富集；此方法建库效率高，覆盖均一性好，但操作较为繁琐，建库周期较长；该方法在2017年已经升级至2.0版本，上述不足得到了优化 [7]。

3. 末端加尾法

末端加尾法是指利用末端转移酶 (TDT) 向底物3’端添加同聚多核苷酸尾 (Tailing)，再利用尾部序列作为二链合成引物的互补区进行二链合成 (Extension) 后，将另一侧接头连接至双链DNA (Ligation)，通过PCR扩增富集，完成文库构建的方法 [8]。此方法成功与否的关键有三点：1) TDT酶的底物利用率，直接关系到建库效率和文库丰富度，最终影响有效数据量；2) TDT酶的加尾偏好性，该特性会影响测序数据的覆盖均一性；3) 底物加尾长度，一方面，加尾过长会降低二链合成引物与尾部序列的退火效率，影响建库效率；另一方面，过长的尾部Poly序列会进一步加剧BS文库的碱基不均匀性，降低测序质量；加尾长度可以通过调整反应缓冲液或混入双脱氧核苷酸进行控制 [8][9]。

图4：三种转化后建库思路

除了通过PBC策略优化甲基化测序流程，BS-Free也是未来值得关注的方向，三代测序可实现BS-Free的甲基化检测，但目前在应用上存在一定局限。

参考文献：

1. Plasma DNA tissue mapping by genome-wide methylation sequencing for noninvasive prenatal, cancer, and transplantation assessments. PNAS , 2015 , 112 (40) : E5503

2. Identification of methylation haplotype blocks aids in deconvolution of heterogeneous tissue samples and tumor tissue-of-origin mapping from plasma DNA. Nature Genetics, 2017 , 49 (4) : 635

3. DNA methylation analysis: speedup of bisulfite-mediated deamination of cytosine in the genomic sequencing procedure. Proceedings of the Japan Academy, 2004 , 80 (4) : 189-194

4. Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters. Nucleic Acids Research, 2001, 29 (13) : 65-5

5. Amplification-free whole-genome bisulfite sequencing by post-bisulfite adaptor tagging. Nucleic Acids Research, 2012, 40 (17) : e136

6. A High-coverage Genome Sequence from an Archaic Denisovan Individual. Science, 2012, 338 (6104) : 222-6

7. Single-stranded DNA library preparation from highly degraded DNA using T4 DNA ligase. Nucleic Acids Research, 2017, 45 (10) : e79

8. TELP, a sensitive and versatile library construction method for next-generation sequencing. Nucleic Acids Research, 2015, 43 (6) : e35

9.  Homopolymer tail-mediated ligation PCR: a streamlined and highly efficient method for DNA cloning and library construction. Biotechniques, 2013, 54 (1) : 25