近些年来，随着基因组学技术的迅猛发展，精准医学的理念逐渐得到推崇并日益深入人心，遗传性疾病的诊断迎来了新气象。根据此前统计数据，我国新生儿出生缺陷率约为5.6%，而且呈逐年上升态势，在巨大的人口基数下，我国出生缺陷患儿的绝对数量十分庞大，每年新增出生缺陷儿约90万例，平均每30秒就有一名缺陷儿出生，每年国家和社会的经济负担高达数千亿元。在如此残酷的生育数据背后，无数家庭正承受着出生缺陷带来的不幸…… 随着现代医学的进步，所有学科在临床工作中都将面临遗传疾病的挑战。近日，测序中国对话了上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心分子诊断实验室主任王剑，共同探讨了下一代测序技术为遗传病诊断带来的机遇与挑战。

测序中国：王剑教授，您好！随着分子检测技术的高速发展，遗传性疾病的诊疗迎来了新的机遇。您能否介绍一下目前遗传病诊断的常用方法？下一代测序技术在其中发挥了怎样的作用？

王剑教授：人类基因组变异的范围大小可以从单个碱基到整条染色体不等，主要可分为染色体异常、拷贝数变异以及单个或多个碱基的变异。根据变异大小的不同，经典的基因检测方法有染色体核型分析、基因芯片、荧光原位杂交、多重连接依赖的探针扩增和一代（Sanger）测序等，但这些传统方法均有一定的局限性。下一代测序（Next generation sequencing，NGS）是最近十年诞生的全新的DNA测序技术，它能同时对几十万至几亿的DNA分子进行平行测定，与传统的一代测序技术相比，具有高通量、高敏感性等优势，因此也称为“高通量测序技术”，可以说是对传统Sanger 测序革命性的改变。

随着NGS技术的成熟、费用的降低和实验周期的缩短，基因检测技术在大规模人群中的运用逐渐成为现实。目前NGS正越来越广泛地被应用于科学研究和疾病的临床诊断中。

在科学研究方面，NGS已成为目前鉴定罕见病新致病基因最重要的研究工具，同时也可以帮助寻找肿瘤等多基因疾病的致病易感基因、探索致病机理等。在疾病的临床诊断方面，随着NGS技术的不断完善和生物信息学技术的高速发展，近几年来NGS正逐步被用于临床诊断的实践领域，利用测序信息结合临床表型可对遗传性疾病做出正确的分子诊断。只要有生命传承，就有发生遗传病的可能，毋庸置疑，在遗传病的诊断中，NGS技术已逐渐成为一项不可或缺的检测手段，也必将在未来发挥出更加关键的作用。

测序中国：在NGS技术的应用及研究中，全基因组测序、基因包panel和全外显子组测序是最常见的三种策略，您是如何看待这几种策略的？

王剑教授：NGS按测序目标序列的大小可分为全基因组测序（Whole genome sequencing，WGS）和靶向重测序（Targeted resequencing）。靶向重测序又可分为全外显子组测序（Whole exome sequencing，WES）、临床外显子组测序（Medical exome sequencing，MES）、靶向疾病基因包panel等。

目前全基因组测序（WGS）已经开始常规性地用到拷贝数变异（CNV）的分析上，因为以很低的覆盖度（比如0.1X）也能检测出全基因组范围内的CNV，而且成本不超过目前一般的染色体芯片。但目前全基因组测序还没有常规性地用于测序变异的检测，因为要检测序列变异，要求的覆盖度需在30X。因此，在这种情况下，测序的成本还比较高，这也无疑限制了这一策略的使用。

基因包panel的检测对临床有特异表型但遗传异质性较强，对需要进行分辨诊断的病种较为合适，比如耳聋、心肌病等疾病。但基因包的临床功效在很大程度上除了取决于临床医生对病种的临床诊断的把握，也取决于已知致病基因能解释这类疾病的比例。此外，由于新基因不断被发现，因此基因包panel也需不断被更新。

对于临床外显子组测序（MES），这一策略包含所有已知的致病基因，但实际上目前技术水平还没有做到，也无法做到。一是因为新致病基因的发现速度很快，二是许多曾经我们认为的致病基因事实上不是或还没有足够的证据支持是确凿的致病基因。而全外显子组测序（WES）则包含绝大部分编码的区域，虽然其实际内容因公司产品设计不同有很大差别，再加上在测序过程中难免会有一些区域的覆盖度不够，但和全外显子组测序已经取得的临床贡献相比，这只是一些小小的不足，并将会得到不断完善。此外，全外显子组测序除了能检测已知遗传病的序列变异外，新近发现的致病基因也会得到检测，同时也有机会发现新的候选致病基因。因此，全外显子组测序能够以相对更低的检测成本创造更高的临床价值，在有条件时，对临床表型复杂、临床表型不特异、临床诊断不明或因为病人的临床表型还没有展示的病例，全外显子组测序是理想的检测手段，也是发现新致病基因的有效策略。

我们寄希望于测序技术的突破，我们也坚信，技术的发展最终会让我们步入全基因组测序的时代。也许在今后的几年里，有机结合全外显子组合中低覆盖度全基因组测序能够满足检测各种变异的需求。

测序中国：高通量测序技术为遗传性疾病的诊疗揭开了新篇章。当前在遗传性疾病的诊断中，您认为还存在哪些突出的问题？

王剑教授：测序技术的革命发展为遗传病诊断从业人员带来了新的挑战，技术的规范应用和数据分析等诸多问题也亟待加强，在目前遗传病的诊疗中，我认为还存在以下几个突出的问题。

1. 临床医生初步鉴别遗传性疾病的能力有待加强

当前阶段，遗传性疾病的诊断周期长、诊断率较低。虽然绝大多数罕见病都有遗传基础，但致病原因还包括感染、环境毒理、饮食及化学物暴露等非遗传因素。在临床上有效鉴别是否为遗传性疾病，能提高NGS对罕见病的诊断率，从而间接降低医疗成本，提高临床功效性。要做好鉴别并不容易，要综合考虑许多因素，临床医生需要对先证者的家族史、孕史、家庭社会生活环境有全面的了解。一般多于一个家庭成员（特别是一级亲属）、多发性流产、死胎和儿童死亡中出现相同的病症时强烈表明遗传性疾病。在相对年轻的两个或更多个亲属中发生的常见成人病症（心脏病、肿瘤、痴呆等）的家族史也表明遗传倾向。一些相对常见的临床症状如发育迟缓/智力落后和多发性先天性畸形已知有较强的遗传因素。通常涉及心脏和面部以及生长问题的情况，特别是如果患者同时表达可能指示综合征的多个临床特征时，也提示有遗传病的可能。

2. 海量变异的临床意义正确分析是目前最大的问题

分析序列变异的临床意义确实不是一个简单或直接的过程。以前报告的致病变异也未必是真正的致病性变异，因此变异的临床意义应基于最新的证据进行分析。一些以前分析过的变异在一段时间后或有新的证据出现后，需要重新进行分析，所以这也是一项持续性的工作。不同实验室有时会对同一个变异做出不同的结论，这里面存在原则性问题，也有对原则理解的问题。ACMG/AMP对测序变异的致病性变异分析指南为我们制定的统一的原则，使得变异分析有规可循，但对原则的不同理解也任然会导致不一致的结论。加上我们对疾病基因致病机理了解的还不够充分，同一基因会以不同的变异方式导致不同的疾病，共享人群数据库中缺乏足够的中国人的参照数据，这些都给我们分析变异的临床意义增加了难度。有时对一个变异的分析需要花不少时间查找阅读不少文献及数据库，有时即便如此也不一定能得出比较肯定的结论，致使目前很大部分的变异只能归类为临床意义不明。

3. 缺乏专业的遗传咨询

检测报告发送不代表检测的结束，遗传咨询是遗传检测不可缺少的重要环节，遗传咨询的对象包括送检医生及病患和家属，国内还没有一套针对新一代测序特别是全外显子测序检测继续遗传咨询的原则和操作规范，对于这方面工作，需要在实践和研究中总结发展。

测序中国：当前阶段遗传病诊断存在诊断率低、诊断周期长等问题，造成这种情况的原因有哪些？基于这些问题，我们应该如何进行改进？

王剑教授：提高诊断率、缩短诊断周期可以间接降低医疗成本，使临床尽早采取合理的治疗决策，为病人提供精准的治疗方案，在临床上有着重要的意义。而诊断周期的很大程度上取决于测序周期。因此，对于这两个问题，我认为主要有以下几方面原因及解决策略。

1.缺乏标准化和自动化的实验流程。NGS实验流程复杂，建库、杂交等步骤需要大量的手工实验，实验时间长且容易出错，这是遗传病诊断周期长的重要原因。唯有采取无缝运营的流程，大幅度缩短测序周期，才能缩短诊断周期，最终提高诊断效率。实验室方面需要对测序数据进行严格的质量控制及有效性评估，并逐步往自动化实验、信息化管理发展。

2.在选择基因检测项目和变异解读方面，目前从业人员所掌握的专业知识及经验“良莠不齐”，有可能会遗漏真正的“致病性”变异或选择了不合适的基因检测项目。比如脊髓性肌萎缩症SMA，因为多为7，8号外显子缺失且有同源基因序列干扰，所以一般应该选择MLPA、荧光定量PCR等方法，如果选择NGS就容易漏检。这就需要培养大批训练有素的临床遗传医师和遗传咨询师，因全外显子组测序这样复杂检测的需要，因此也需要培养临床基因组专家。

3.临床表型描述不详实，甚至作出错误的表达或诊断，造成后续数据分析变异解读时发生严重疾病方向性偏差。因此，临床需要适当加强医学遗传学知识普及，临床医生需要对临床表型信息进行完整的确认及标准化的表达，并选择恰当的基因检测方法。

4.各个实验室需要考虑经济成本方面的原因，致使文库捕获效率、数据质量方面差异较大。另外，上机测序成本也是目前需要考虑的问题之一，大型测序仪往往可以大大降低测序成本，但中小型实验室往往需要积累很长时间才能凑足上机的样本量，导致实验周期拉长。

测序中国：在遗传性疾病的诊断中，测序机构、临床医生及遗传咨询师等将分别扮演什么样的角色？我们应该如何使三者有机地结合到一起？

王剑教授：临床医生是整个遗传性疾病的诊断中的最重要一环，需要能够初步鉴别遗传性疾病，详细准确地记录并描述患者的表型，并选择合适的基因检测方法。当拿到检测报告后，临床医生还需要结合临床表型与基因型，通过查询病例文献、会诊讨论等，最终诊断是否为遗传病，并采取最有利于患者的处理方法。

测序机构需要不断对检测技术平台及检测项目进行优化、验证等，并建立一个标准化的流程（SOP）和质量保障措施，以保证检测的技术有效性。出具临床报告应该严格遵守ACMG等专业学会指南，报告的变异应该和患者的临床表型有关联，需要分析界定可报、不可报的基因/变异种类。实验室间还需要共享经验，共享变异分析的结果、临床资源等，从而达到共赢的目的。

遗传咨询师的主要工作包括为临床医生及病人就基因检测报告提供针对性的诠释及咨询，包括分析确定遗传模式，评估疾病或症状的发生风险与再发风险以及提供下一步的建议；解释遗传疾病的发病原因、疾病自然发展史、临床表现与可能的干预及治疗措施，预后情况；使用心理评估识别病患及家属在情感、社会、教育以及文化等方面的理解及接受问题；评测客户和/或家庭对出现疾病或存在疾病发风险的理解及反应程度；充分了解并为病人及家属提供有效的医学、教育、经济以及心理等社会资源，包括权威性的信息源（书籍文献网站等），专家库，互助组织等信息；引导病患及家属参与诊断及研究项目，提供知情同意的解释。

这三者是一个彼此紧密联系的有机整体，缺一不可。彼此应该相互尊重、相互学习，共同提高。各方应意识到，大家的目标是一致的，即帮助遗传病患者及家属能够获得及时、准确的诊断，并得到并采取有效的临床治疗决策。

同时，与国外相比，我国遗传医师与遗传咨询师培训体系严重落后，目前主要的任务是培养一批懂基因组科学，也有一定临床知识的遗传咨询师。遗传咨询是个体化医学的具体体现，因为为一个病例家庭都有属于自己的情况，所以要求针对每一个病例有个体化的咨询方式和内容。我们也应该清醒地认识到遗传咨询还远远做不到精准，因为变异的临床意义、疾病的临床表现都有很大的可变性，对于许多疾病在中国病人中的临床表型，我们还了解甚少，我们需要鼓励临床医生不断总结和发表罕见病的自然史、预后、治疗效果等经验，为更精确的咨询提供依据。

测序中国：您认为遗传性疾病的诊断在未来有着怎样的发展机遇？

王剑教授：NGS技术的发展使我们能在较短的时间内以较为合理的成本进行个体化的基因组测序，自2009年用于遗传病的研究与诊断以来，从根本上改变了传统的遗传病基因诊断思路和流程。可以在没有明确的临床诊断的情况下，通过基因突变的证据达到对罕见遗传病的明确诊断，甚至在一些特殊的病例及家系中能揭示新的候选致病基因。

未来，随着对人类疾病研究的不断深入，NGS技术的不断进步以及变异数据库的建立和相关法律法规的完善，NGS在遗传病临床分子诊断领域的应用将逐步普及。我们应该积极与美国等医学遗传学体系较完善国家的相关组织积极沟通交流，并多邀请一些华人遗传学家多参与我们国家的体系建设及人才培养等，以看齐国际先进水平为起点，搭建高标准建设平台，加强国内外的合作和交流，建设具有我国特色的基因产业。我相信，未来必将有更多的遗传病患者及家庭能够获得及时、准确的诊断和个性化的遗传咨询，得到有效的临床治疗决策。