免疫组库（Immune Repertoire，IR）是指某个个体在任何特定时间点其循环系统中所有功能多样性B淋巴细胞和T淋巴细胞的总和。T细胞和B细胞分别介导机体的细胞免疫和体液免疫应答，分别通过其表面的T细胞受体（TCR）和 B细胞受体（BCR）来识别和结合抗原，进而发挥功能清除病原体或体内肿瘤细胞。
免疫组库高通量测序是通过多重PCR或SMART RACE法扩增TCR/BCR全长或CDR3区序列（主要是TCR的β链或BCR的重链），再结合高通量测序技术，对机体免疫组库的多样性及每种 T、B细胞克隆的独特性序列组成和变化进行分析，从而全面评估机体的免疫状态，明确疾病与T、B细胞克隆组成及变化之间的关系。随着免疫组库高通量测序技术的不断发展和成熟，基于免疫组库多样性变化特点的生物标志物发现、肿瘤等疾病疗效预测、疾病的易感性和抵抗性、感染性疾病及疫苗研究等方面都取得了重要进展。
在中国，绝大多数肝癌病例源自乙型肝炎病毒感染。由于肝癌是高度异质性的，不同的患者中可观察到不同的免疫反应，肿瘤组织和癌旁组织之间的免疫微环境千差万别。因此，通过免疫组库测序分析肝癌肿瘤组织和癌旁组织中的TCR多样性有助于研究分析患者的发病机制、免疫反应和寻找与肿瘤抗原相关新的生物标志物。
Vβ和Jβ基因片段是TCR库的主要成分。在这项研究中，与癌旁组织相比，在肿瘤组织中可以观察到更为多样化的Vβ基因片段和CDR3 aa克隆型，而排名前五的CDR3 aa 克隆型的百分比和 HEC比率明显高于癌旁组织。这些结果与 Gini 协同系数、Simpson指数以及NSDE保持一致，并且表明其TCR多样性高于肿瘤组织中的。此外，可在邻近非肿瘤组织基础的HBV感染中观察到一些寡克隆的扩增。其他肿瘤的研究，如透明细胞肾细胞癌和结直肠癌，表明：与相邻的非侵入性的肾组织或邻近的黏膜组织比较，在肿瘤组织中的TCR多样性明显要低。
本研究分析了48例肝癌患者TCR中的VJ 组合。一些固定的VJ组合可在肝癌组织中观察到。例如，TRBV17 只与所有96个样品中的J1-2、J2-1 和 J2-6组装，并且TRBV22-1只与J1-3、J2-2、J2-3、J2-4和J2-7组装。还确定了60个只出现在肿瘤组织中的VJ组合，12 VJ只出现在癌旁组织中的组合。然而，这些特定的VJ组合出现频率较低（0.001～0.4%）。这些特定的VJ组合和共享克隆是否与肿瘤抗原相关，还需进一步研究。
总之，本研究利用5'RACE技术结合高通量测序技术（免疫组库测序），成功分析了乙型肝炎病毒相关肝癌患者的肿瘤组织和邻近非肿瘤组织中的TCR库。研究结果表明，肿瘤组织比癌旁组织具有较高的TCR多样性。肿瘤组织与癌旁组织的相似性和重叠率较低。后续非常有必要进一步开展纵向研究对具体的CDR3序列或基因组合进行功能评估。
研究结果
48例HCC患者分别取肿瘤组织和癌旁组织样本，共96个。对TCR序列进行免疫组库测序分别鉴定得到64个独特的Vβ基因片段，可合并为30个Vβ基因家族；鉴定得到14个独特的Jβ基因片段，可合并为2个基因家族。在肿瘤组织和癌旁组织间Vβ基因片段数量具有显著差异（图1）。
图1 肿瘤(C)及癌旁组织(NC)中TRBV基因片段的数量
从VJ基因片段使用热图（图2）可以得知，肿瘤组织和癌旁组织Vβ和Jβ基因片段使用类型相似，但是癌旁组织中某些Vβ和Jβ基因片段展现极高的使用频率（如TRBV20-1、TRBV9、TRBV10-3、TRBV5-4、TRBV10-2和TRBJ2-7、TRBJ2-1、TRBJ1-5）。比较肿瘤和癌旁组织中Vβ和Jβ基因片段使用频率后，共鉴定得到25个Vβ和2个Jβ基因片段具有显著差异（图3）。
图2 肿瘤及癌旁组织中Vβ和Jβ基因片段使用频率热图
图3 肿瘤（C）和癌旁组织（NC）中使用的Vβ和Jβ基因片段的比较。（图A）25个Vβ基因片段的使用频率；（图B）2个Jβ基因片段的使用频率
进一步对肿瘤组织和癌旁组织中TRB CDR3多样性进行分析（图4），图4A肿瘤组织中CDR3 aa克隆类型显著高于癌旁组织（2259 vs. 1324, p < 0.001），不同年龄段分组（图4C）也得到同样的结果。但是60岁以上的患者的CDR3 aa克隆类型显著高于40-60岁年龄组（2410 vs. 1494，p = 0.020，图4B）。CDR3 aa克隆类型与性别无关（图4D）。
图4 CDR3 aa克隆类型多样性的分析。（图A）肿瘤（C）和癌旁组织（NC）中CDR3 aa克隆型数量的比较；（图B）不同年龄组CDR3 aa克隆型数量的比较；（图C）不同年龄组肿瘤（C）和癌旁组织（NC）中CDR3 aa克隆型数量的比较；（图D）不同性别CDR3 aa克隆型数量的比较
运用Gini协同系数、Simpson指数和归一化 Shannon 熵（NSDE）比较肿瘤和癌旁组织中TCR CDR3多样性。结果表明，肿瘤组织中TCR CDR3多样性显著高于癌旁组织（p < 0.01，图5）。
图5 肿瘤和癌旁组织中TCR CDR3多样性。TCR CDR3多样性的Gini协同系数（A），Simpson指数（B）和NSDE（C）比较
为进一步区分肿瘤组织和癌旁组织，研究人员分析比较了VDJ基因和CDR3 aa克隆类型丰度的多维分布（图6）。VDJ基因丰度的多维分布图可以清晰地区分肿瘤组织和癌旁组织，而利用CDR3 aa克隆类型丰度的多维分布图集聚，并不能对两个类型的样品加以区分。
图6 多维分布图
Chen et al. High-throughput T cell receptor sequencing reveals distinct repertoires between tumor and adjacent non-tumor tissues in HBV-associated HCC. OncoImmunology, 2016.（IF 7.719）
技术流程
技术特点：
（1）采用免疫组库扩增最可靠的SMART RACE法，保证结果的可靠性和后期研究的方便性；
（2）采用最优选最可靠的扩增和建库试剂，保证组库序列扩增的保真性和扩增效率；
（3）针对不同样品类型（细胞、组织、全血），不同浓度梯度细胞数（105-107个淋巴细胞）均可建库测序；
（4）运用国际认可的专业的免疫组库分析模块，并结合华银独有的生物信息分析算法，所提供的标准化的分析流程即可满足科研或临床所需；
（5）根据项目研究目的不同，可选择不同的测序平台（MiSeq或HiSeq）和策略，得到最满意的性价比。
免疫组库扩增策略选择
文库扩增模板DNA与mRNA优缺点比较
多重PCR和SMART RACE优缺点比较
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