蛋白磷酸化是细胞信号转导的初级载体之一，也是癌症研究和药物研发的一个主要研究领域。激酶是一种催化蛋白磷酸化的酶类，激酶抑制类药物是癌症靶向治疗的主要类型之一，一系列研究小组都在探索利用磷酸化蛋白质组学分析来帮助选择合适的治疗方法，以及追踪患者对于治疗的应答反应。

例如，美国安德森肿瘤中心的研究人员Gordon Mills使用反向蛋白芯片分析了上千名患者的癌症信号通路，希望鉴定出患者的亚型和治疗方法。乔治梅森大学应用蛋白质组学和分子医学中心Emanuel Petricoin同样也采用了RPPA法分析肿瘤信号，并指导患者治疗。最初由乳腺癌慈善团体Side-Out Foundation发现的结果表明，使用磷酸化蛋白质组学数据指导患者治疗可以延长转移性乳腺癌患者的无进展生存期。

随着质谱检测灵敏度的不断提高，这些方法可以用于肿瘤信号分析。纪念斯隆凯特灵癌症中心的研究人员近期发表了一种质谱方法，他们计划在接下来的临床试验中使用该方法检测癌症信号活性，最终指导癌症治疗。

然而，这些工作都只关注于肿瘤组织的分析。这就给我们带来了一些挑战，因为有些患者的肿瘤组织无法获取并用于活检，即使有些情况下能够进行取样活检，这种取样也无法频繁进行。

在基因组学中，这些限制因素促使研究人员和公司开始寻找液体活检方法，其中包括分析由肿瘤流入血液中的ctDNA。但采取相同的方法进行血液磷酸化蛋白质组学分析并不容易实现，因为血液中这类分子的浓度非常低，而且血液中的磷酸化蛋白质通常会在循环磷酸酶作用下快速去磷酸化。

大部分磷酸化蛋白并不会第一时间进入血液中。即使磷酸化蛋白由肿瘤释放，它们也会立即去磷酸化，因为磷酸酶非常活跃而且含量丰富。人们之前尝试利用血液和尿液样本进行磷酸化蛋白质组学分析，但这些分析出现的时间很短。

为了摆脱这种限制，Tymora Analytical Operations公司总裁及CTO Anton Iliuk和同事们在循环细胞外膜泡（EVs）中分析这种磷酸化蛋白质，例如微泡和外泌体，这两者都含有来自起源细胞的遗传物质和蛋白质。目前，很多研究人员都在尝试将外泌体作为潜在的临床样本，如诊断公司Exosome Diagnostics和NX Prenatal则对外泌体相结合的RNA和蛋白质进行测定，对前列腺炎和早产等情况进行检测评估。

Iliuk团队今年年初在PNAS上发表文章，他们在30个乳腺癌患者和6名健康对照个体中进行血浆细胞外膜泡检测，结果鉴定出144个蛋白质在癌症患者体内会出现高度磷酸化。研究人员利用Thermo Fisher Q Exactive HF仪器对其中四种蛋白质进行靶向质谱分析，发现其中三个蛋白质（RALGAPA2、PKG1、TJP2）在乳腺癌患者中的磷酸化水平更高。

来源：Tymora公司官网

研究中引用Tymora公司发明的磷酸化蛋白富集方法——PolyMAC，利用携带金属离子的可溶性纳米高分子在复杂的复合物中捕获磷酸蛋白。另一方面，研究人员是使用超速离心法收集细胞外膜泡，然而这种方法不易重复，而且细胞外膜泡复原率很低。因此，团队开发了一种基于微流体的方法，通过使用一种微流体墨盒来捕获细胞外膜泡。在使用少量电压进行靶分子的原位提取后就进行捕获，这种方法让研究人员能够获得体内的磷酸化蛋白，且在这个过程中不会使其降解，进一步优化了靶向细胞外膜泡捕获方法和体内磷酸化蛋白质提取方法。

近日，普渡大学和Tymora Analytical Operations公司的研究人员开发了一种用于血液或尿液磷酸化蛋白质组学分析方法，将微流控型微泡和外泌体捕获法与Tymora的磷蛋白富集试剂相结合，通过血液或尿液样本分析肿瘤信号通路，这与利用ctDNA分析进行液态活检的方法类似。他们希望利用该方法检测并处理各种不同的癌症。

虽然这项工作仍然处于早期阶段，Iliuk期望将这种方法作为循环肿瘤细胞和ctDNA分析之外的另一种液态活检方法。采用这种方法不需要采集活体组织或有肿瘤出现就可以进行液体活检，能够持续性监控疾病，而不是等到有可获取的活体组织时才开始检测。

目前，Tymora公司正在寻求肿瘤研究领域的商业合作伙伴，希望进一步探索某些癌症的研究方法。该公司同时还在开展一项内部项目，利用尿液中细胞外膜泡的磷酸化蛋白组学分析监控膀胱癌术后复发率。研究人员已经在膀胱癌患者和健康人群间发现了大量磷酸化差异，因此，他们正在尝试开发检测试剂盒进入诊断领域。

此外，Tymora公司还致力于将其微流体式细胞外膜泡捕获和提取平台商业化，作为其他研究人员研究细胞外膜泡时的一个工具。