韩国基础科学研究所（Institute for Basic Science，IBS）、韩国首尔大学等机构的研究人员设计出了迄今为止最小的CRISPR-Cas9，并通过腺相关病毒（AAV）将其递送到小鼠肌细胞和眼睛里，用来编辑导致失明的基因。这一研究成果发表在《Nature Communications》上，这种CRISPR-Cas9系统源自空肠弯曲杆菌（CjCas9），预计将成为一种有效的治疗常见和“无用药靶点”疾病的新工具。

CRISPR-Cas9是一种用来编辑基因的创新、便宜且精确的技术。Cas9作为“基因剪刀”蛋白，需要在向导RNA的指引下到达精确位置对靶基因进行切割。为了使CRISPR-Cas9复合物到达靶DNA的位置，就需要通过质粒或病毒递送。IBS基因组工程中心主任KIM Jin Soo解释说：“AAV是一种在体内表达目标基因的有效且安全的载体，并已被广泛用于基因治疗。”

自然情况下，Cas9是几种细菌的免疫武器，用来切割可能损害细菌的病毒DNA。最常见的CRISPR-Cas9技术使用的是细菌化脓性链球菌的Cas9（SpCas9）。然而，该蛋白质由1,368个氨基酸组成，体积太大不能利用AAV来包装和递送。即使科学家将它分成两部分，分别包装在不同的病毒中，也会出现其它的问题，例如需要两倍量的病毒来实现递送，且其活性比完整的SpCas9低。金黄色葡萄球菌Cas9（SaCas9）也可用于基因编辑，它的体积稍小（1,053个氨基酸），因此可通过AAV递送，但没有剩余足够的空间来装载其它蛋白。

在该研究中，研究团队发现CjCas9既高效又小。CjCas9有984个氨基酸，可以与多个向导RNA以及荧光报告蛋白一同包装进AAV中。

为了使用细菌蛋白质进行基因编辑，研究人员对这一技术进行了优化。他们设计了一个短的DNA序列，紧挨着由Cas9靶向的DNA序列，即Protospacer Adjacent Motif（PAM）。每个不同的Cas9需要特定的PAM序列，否则将不能结合和切割靶DNA序列。另外，研究人员还修改了向导RNA的长度。

然后，研究人员将新的CRISPR-Cas9复合体与两个向导RNA和荧光报告蛋白一起包装到AAV中，递送到小鼠肌肉和眼睛中的突变基因位点。他们的目标是年龄相关性黄斑变性（AMD）相关的两个基因，这疾病是成年人失明的主要原因之一。其中一个基因是AMD的常见治疗靶标，称为血管内皮生长因子A（VEGF A），另一个基因是激活VEGF A转录的转录因子，称为HIF-1a。与VEGF A不同，HIF-1a此前并未被当作药物靶点。在这项研究中，研究小组证明CjCas9通过AAV递送到视网膜可以有效地使小鼠中的Hif-1a和VEGF A失活，并减少脉络膜新血管形成（CNV）的面积。

向眼内注射利用AAV包装的CRISPR-CjCas9，可以有利于治疗各种视网膜疾病和全身性疾病。KIM Jin-Soo解释说：“CjCas9是高度特异性的，不会导致基因组中的脱靶突变。”

Hif-1a基因靶序列在小鼠和人中是相同的，因此本研究中提出的方法将来可用于人类AMD患者的治疗。通过为CjCas9编辑“非药物靶点”基因或非编码基因铺平道路，这种技术可以扩大治疗靶点的范围，使整个人类基因组都成为潜在的药物靶点。

参考文献：

In vivo genome editing with a small Cas9 orthologue derived from Campylobacter jejuni. Nature Communications (2017). DOI: 10.1038/ncomms14500

The Smallest Cas9 Genetic Scissors (so far)