染色体复杂结构变异（cxSV）包含多个结构变体的基因组重排，它们对人类基因组变异有很大影响，并可能导致孟德尔疾病，但是由于基因测序技术的限制，通常会在临床基因检测中忽略它们。但随着高通量测序的快速发展，NGS技术已经能够实现高精度测序，有助于研究更复杂形式的SV，而长读长测序技术的开发使科学家能够获得更长读长的序列，结合生物信息学，进而获得更丰富的基因信息，帮助寻找更多的致病基因，也使cxSV的致病机理研究成为可能。

近日，来自剑桥大学医院NHS基金会信托基金及其合作单位的研究人员报告了一项最新研究成果，研究人员使用纳米孔测序等不同测序方法，分析了1324名未确诊的罕见病患者的cxSV，发现cxSV位点会对评估潜在致病基因产生重要影响，并且研究人员利用纳米孔测序帮助一位罕见病患者确定了SV致病机理，该研究已发表于BioRxiv预印本中。

该研究的高级作者之一、剑桥大学研究助理Keren Carss表示，在过去的一年中，她的研究小组对染色体结构变异（SV）的致病机理越来越感兴趣，并且在寻找与已知疾病基因重叠的结构变异过程中，意外发现了一个奇怪的SV，该SV由同一区域的两个重复和一个反转序列组成，这一发现激起了我们的研究热情，我们想要系统地研究这个问题，以了解它导致的疾病在我们的病人中有多普遍。

研究人员分析了英国国立卫生研究院（NIHR）的生物资源，囊括了来自常见病和罕见病患者以及健康志愿者的DNA样本，研究人员还对未诊断的罕见病患者进行了短读长全基因组测序，其中包括来自三个项目的患者样本，分别为遗传性视网膜疾病项目的725个样本，神经和发育障碍项目的472个样本以及Next Generation Children项目的127个样本。

在从短读长测序中调用结构变体数据后，他们通过聚类相邻SV用于鉴定疾病相关基因中可能的复杂结构变体（cxSV），确定了81个疾病相关基因中可能存在的候选cxSV，在手动评估并重建其可能的结构体系后，研究人员将数量削减到46个，但他们发现这其中的42例并不太可能致病，因为患者表型与被破坏的基因不一致，或者患者在隐性疾病中为杂合子。

图：全基因组测序鉴定的四种cxSV

A：Coffin-Siris 综合征，B：癫痫、智力障碍，C：锥细胞营养不良，D：新生儿缺氧缺血性脑病

对于疑似与临床相关的四例cxSV，研究小组使用Sanger测序确认了预测的新位点，并确定了预测的拷贝数变化和纯合区域的微阵列，发现四例均为携带影响孟德尔疾病相关基因的cxSV个体，其中三例cxSVs是致病性的，分别引发了Coffin-Siris综合征、智力障碍、癫痫等罕见病。

此外，研究人员在分析一名新生儿缺氧缺血性脑病患者的全基因组测序数据时，发现在他的X染色体上存在与CDKL5基因重叠的重复伴性反转SV。同时，短读长测序数据为该cxSV提供了两种可能的体系结构，一种是CDKL5的第二个拷贝是完整的，另一个是CDKL5的第二个拷贝被破坏了。由于单独的Sanger测序无法证实任何结构模型，因此研究人员将目光投向了纳米孔测序，该测序方法能够覆盖所有的位点，并证实了CDKL5完整拷贝的存在，进而证明了SV与罕见病的遗传关联，鉴于复杂SV可能会影响基因调控，研究人员最终将其称为意义未明的基因变异。

尽管该研究中仅有0.3％的患者被发现存在可能与疾病相关的复杂SV，但Carss认为由于研究评估具有保守性，所以实际临床中可能更多，因为可能有些患者会被阵列发现具有拷贝数变异，但事实上他们是携带cxSV，除非做了更详细的研究分析，否则你可能不会发现它。“虽然此前我们并不认为这种变异会导致很多孟德尔疾病，但我们的研究结果显示cxSV是孟德尔疾病的一个重要但罕见的原因，因此建议在研究和临床研究中考虑这一点。

Carss表示，其他团队使用不同的方法分析cxSV，尽管短读取测序技术能够为重复区域提供更好的分辨率，但却将读取长度限定在5000bp左右，而将其与纳米孔测序结合就能避免这一弊端。

业内其他科研人员对这项研究表示了肯定，称该研究证实了罕见的结构变异和拷贝数变异作为罕见疾病的原因。荷兰Radboud大学医学中心免疫基因组学教授Alexander Hoischen表示，这项研究证明一些SVs / CNV远比我们最初想象的更加复杂，同时该研究也成为敦促研究人员使用长读长测序技术，如Oxford Nanopore Technologies或Pacific Biosciences，帮助诊断一些罕见病例。他表示，目前他的研究团队也正在该测序技术的帮助下系统研究罕见病，且已经确定了总共23000个SV和30000个以上的插入和缺失突变，其中大多数在短读长测序数据中不会经常被识别。

Hoischen表示，从长远来看，我们需要一种真正适用于所有罕见疾病患者的通用基因检测方法，而长读长测序技术是目前比较好的一种选择。

同样，Carss认为cxSV倾向于出现在基因组中重复且难以按常规顺序排列的序列区域。临床上，如果目的基因位于删除或重复基因序列附近，那么精确定位cxSV将尤其重要，因此，长读长测序技术，如纳米孔测序，将成为解决这些问题的最有效方式。在更大的患者队列中使用长读长测序技术可以更深入地了解这些变异类型的频率和分布。但由于纳米孔测序的错误率相对较高，并且覆盖率较低，所以还不能被单独，但这一技术正在迅速改进。

该研究已经证明研究SV否致病的重要性，短读长和长读长全基因组测序技术联合应用可以为解决这一问题提供有效方法，并且证明长读长测序技术能够为精确cxSVs的临床解释提供强大的技术支持。虽然这一研究领域还没有达成相关共识，用于确定SV的特征及其致病性，但这一研究阶段的发现比临床诊断检测更加重要，并且有助于进行产前诊断，预防出生缺陷。

基因测序技术正在从科学研究向临床诊断快速转化，所以在未来的几年里，这些测序技术和研究发现很可能会被用于临床实验室，为罕见病的诊治贡献一份力量。

参考文献：

1.Long-Read Sequencing May Help Resolve Complex Structural Variants to Diagnose Rare Diseases

2.Complex Structural Variants Resolved by Short-Read and Long-Read Whole Genome Sequencing in Mendelian Disorders