单细胞测序近年来发展得非常迅速，能够揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态，反映细胞间的异质性，在肿瘤、发育生物学、微生物学、神经科学等领域发挥重要作用，帮助人们揭示了复杂生物学体系的许多重要过程。

4月26日，国际顶级学术期刊Science同时发表3篇文章，共同揭示了斑马鱼和非洲爪蟾胚胎发育过程中的细胞分化过程，成功绘制了细胞分化与基因表达轨迹。

斑马鱼胚胎发育

据其中一篇论文报道，哈佛大学和Broad研究所的研究人员合作开发了一种名为URD的计算方法，研究人员使用一种被称为Drop-seq的单细胞RNA-seq方法对斑马鱼胚胎细胞进行了检测，范围从受精后三小时到受精后12小时的发育阶段，这期间许多细胞已经开始经历分化，最终研究人员重建了斑马鱼的细胞发育轨迹。

研究人员在斑马鱼胚胎发育的最初9个小时内，每隔45分钟采集一次细胞mRNA信息，共分离了694条斑马鱼胚胎25个不同细胞类型的38,731个单细胞，结合分化轨迹，研究人员构建出了史上最全的胚胎形成发育树。

根据试验得到的检测数据，研究人员将其与基于扩散的URD模拟计算工具结合，成功跟踪了研究范围内12个发育阶段的20多个细胞类型的表达动态。在这个过程中，他们将在特定发育阶段表达的基因集固定，同时描述了不同转录类型细胞分化的不同组织类型。

为进行相关性分析，研究小组使用了SMART-Seq2方案生成了更深度的单细胞RNA测序数据，用于区分野生型斑马鱼和突变体斑马鱼的细胞，该突变体为缺少中胚层组织形成的相关基因。

尽管突变体确实存在细胞差异，但检测结果也显示了胚胎突出的可塑性，细胞仍具有相对的发育稳定性，有利于对不同细胞类型进行表型观察。

单细胞RNA测序新发现

另外两篇文章的通讯作者、哈佛医学院的生物学助理教授Allon Klein分别与HMS系统生物学教授Marc Kirschner课题组和HMS系统生物学助理教授Sean G. Megason课题组合作，利用HMS开发的inDrops单细胞RNA测序方法分别绘制了非洲爪蟾和斑马鱼从受精卵到完整胚胎的基因表达图谱。

为能绘制胚胎发育过程中的每一个细胞谱系，同时指示新细胞状态的基因表达事件的精确序列，研究团队开发了包括人工DNA条形码追踪“TracerSeq”在内的一系列新型实验和计算技术，能够为每个胚胎细胞捕获一次基因表达数据，超24个小时记录时间内多个采样时间点。

斑马鱼胚胎发育过程截图

Klein和Megason描述了来自7个不同胚胎阶段的92000个斑马鱼细胞，从4小时胚胎到基本器官开始显现的受精后24小时，代表发育第一天的发育阶段。

试验数据表明，对野生型转录组的聚类能够揭示发育时间内表皮、神经、中胚层和内胚层细胞状态集合，其中许多可以基于标记基因的表达特别注释。利用一种无偏差的基于图形的分析方法，研究人员将这些数据组合在一起，绘制了斑马鱼在时间和空间上的细胞发育轨迹，有助于探索从细胞类型层次结构到分化的所有过程。

Allon Klein

研究团队采用Klein和Kirschner对非洲爪蛙受精卵受精后5小时至22小时期间的10个胚胎阶段的137000个细胞进行了单细胞RNA测序，分析了其细胞轨迹。基因活性数据显示，当爪蛙胚胎看起来是一个未分化的斑点时，其内部细胞的身份（如尾芽）已经定性。

研究人员还将该结果与斑马鱼研究结果进行了比较，发现许多胚胎细胞状态出现的时间比先前认识的要早，并且发现了一些脊椎动物早期发育基因表达程序的保守和发散特征。例如，某些细胞类型的发育路线因物种而异。尽管常见细胞系的关键转录因子相似，但一些细胞类型存在明显的种间非预期差异。

为确认该分析结果，Klein和Megason利用CRISPR/Cas9系统构建了一种腱蛋白（chordin）突变斑马鱼模型，而Schier团队构建的是一个“独眼针头（one-eyed pinhead）”基因途径突变斑马鱼。利用单细胞测序分析了两种突变斑马鱼胚胎，结果证明这些突变会对整个胚胎发育中的细胞和新生组织产生影响。

令人意外的是，尽管两种突变体都分别缺失了一种基本信号通路，但是突变型与野生型的单细胞表达水平基本一致，只是不同细胞类型的比例发生了变化。Klein表示，这一出乎意料的结果直接挑战了我们过去定义某种细胞的根本依据。

参考文献：

1.Single-Cell Transcriptomes Reveal Cell Differentiation Dynamics in Zebrafish, Frog Embyogenesis

2.Single-cell reconstruction of developmental trajectories during zebrafish embryogenesis

3.The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution

4.Single-cell mapping of gene expression landscapes and lineage in the zebrafish embryo