图：NCI

四年前，正当基因测序业务开展得如火如荼之时，两部委（国家食品药品监督管理总局与卫计委办公厅）突然叫停基因测序相关产品和技术在临床医学上的使用，其中就包括无创产前基因检测（NIPT）。一时间，对华大基因、达安基因等公司业务造成较大影响。但仅仅过了一个月，基因测序临床应用便以试点形式规范化开展，正式吹响了中国基因产业的“号角”。NIPT也如凤凰涅磐般在此后的几年中得以迅速发展。

然而，就在最近，一则关于华大基因NIPT“漏检”事件的消息在朋友圈疯转，并引发各大媒体的关注和铺天盖地的报道，NIPT基因检测再次被推向了社会舆论的风口，“华大基因”也因此为行业背了锅。由于对NIPT技术及临床应用的理解偏差，大多媒体背离了“科学与客观”，将责任矛头指向了华大与NIPT这项技术，而规避了医生才是本次事件的关键责任主体。在众多社会舆论的“炮轰”之下，业界专业人士纷纷为此鸣不平。如果因社会舆论的压力导致基因测序临床应用再次被政府“一刀切”，最终受损的仍将是普通大众的权益。

的确，在公众眼中，NIPT不应该只局限于T21、T18和T13，三种最常见的基因疾病，大家对NIPT的期望值很高。但是，我们也都知道，没有哪种技术是十全十美的，那么，限制NIPT技术进一步扩大基因疾病筛查范围的根源是什么？有没有更好的解决办法呢？本文将从专业的角度对这一问题做深入的分析与解读。

1997年，卢煜明教授首次发现了胎儿游离DNA（cffDNA），但是，当时的技术很难对数量庞大的游离DNA（cfDNA）同时进行有效检测；直到2007年，第二代测序技术（NGS）出现，研究人员才找到了一个“称手”的研究工具，同时，科学家很快意识到，该技术的高通量特性也非常适合开展无创产前基因检测（图1左）。

在2008年，有两个研究小组很快完成了基于NGS开展NIPT的概念验证[1、2]，其中一项研究内容如下（图1右），利用高通量测序技术对28位孕妇血液中的总游离DNA进行测序，然后进行序列比对并统计属于不同染色体的cfDNA片段数目；最后，他们发现，在14位不幸怀唐氏综合征（T21）胎儿的孕妇的统计结果中，那些来自于21号染色体的cfDNA片段数均高于怀正常胎儿孕妇；上述方法就是我们现在使用的无创产前基因检测的技术原型。之后，多个大规模临床研究都证明，相比传统唐氏筛查技术，无创产前基因检测具有更高的准确性。

图1. 左：无创产前基因检测发展史[3]；右：NIPT检测流程示意图 [2]

NIPT的主要限制来自于胎儿游离DNA的天然属性，包括以下几个方面，1. 高度碎片化，很难检测染色体结构变异；2. 以较低比例与母体游离DNA混合在一起，母体基因组产生的背景干扰较大，尺度更小的拷贝数变异较难检测；3. 碱基序列与母体区分度小，很难独立分析；4. 胎儿游离DNA主要来自胎盘组织，当胎盘中的细胞与胎儿基因组不一致时，目前的技术也无法辨别。

与完整的基因组DNA不一样，游离DNA呈高度碎片化状态（图2），长度在166bp左右，胎儿游离DNA也不例外，与提取后长达几十Kb的gDNA相比，仅仅利用这些DNA片段的序列信息，我们很难完全复原胎儿的真实基因组状态。就像做拼图游戏一样，两块拼图很容易组装，但要是分割成成千上万个碎片，难度可想而知。上文已经介绍了NIPT的原理是统计cfDNA的数目，比如，如果胎儿染色体拷贝数正常，那么母体游离DNA的测序结果中，与21号染色体对应的cfDNA片段条数大约为50000条，如果是T21胎儿，就会更多一些，比如为52500条。所以，NIPT对染色体倍性变异较为敏感，但如果某些胎儿的基因变异并不改变cffDNA的数量，目前的方法就很难发现，比如染色体倒位、平衡异位等。

图2. 核型分析和无创基因检测的原理示意图

胎儿游离DNA在母体总cfDNA中的浓度随着孕周增加稳定上升，但占比仍然较低（图3A）。由于测序样本中，绝大多数DNA来自母体基因组，所以，一旦母体基因组发生轻微的改变，就会对检测结果产生干扰（图3B），极端的情况就是当孕妇不幸患有癌症的时候。另外有一点值得注意，对于那几万条比对到21号染色体的游离DNA（图2），其实我们并不知道哪些来自母体，哪些来自胎儿，红色的标记是小编自己画上去的，其实测序数据中，它们都被记作一个片段数。也就是说，目前技术是“间接”检测胎儿基因状态。所以，胎源比例就成了是评估NIPT检测准确性的重要参数，胎源比例可以告诉我们某次检测到底检没检测到胎儿DNA，胎源比例过低时，检测到胎儿的游离DNA数量太少，结果将会变得不可信。

图3. A：胎儿游离DNA浓度随孕周变化[4]；B：母体基因组拷贝数变化是NIPT假阳性、假阴性产生的可能原因

如果能降低母体DNA的背景噪音，就可以从源头上改变目前的现状。因此，卢煜明（Y. M. Dennis Lo）和赵慧君（Rossa W. K. Chiu）在2008年提出了一个提高NIPT的检测灵敏度的“NIPT降噪方程式”，包括富集cffDNA，降低母体cfDNA数量，其中，（D）项其实就是NIPT技术的“理想状态”——直接检测胎儿基因状态（图4）。

图4. 提高胎源比例的几种途径[5]

那么，这些想法可以实现吗？其实，在发现胎儿游离DNA之后，科学家们就开始马不停蹄的挖掘cffDNA的特征（cffDNA标志物），它们希望最终能够将胎儿和母体游离DNA区分开来。cffDNA有三个特征具有应用潜力，一个是“遗传特征”，来自父母基因组的大量SNP信息（图5A）；第二个属于“物理特征”，cffDNA的长度更短（图5B）；第三个则是“化学特征”，cffDNA具有有别于母体cfDNA的甲基化修饰，属于表观遗传学范畴。

图5. A：利用单倍型中的SNP信息进行父系遗传诊断[3]；B：胎儿以及母体游离DNA长度分布[6]

目前，基于SNP“相对单倍型剂量“进行无创单基因病诊断完成了概念验证，我们也希望看到这个技术在大规模临床试验中取得积极的结果，由于其原理较为复杂，以后有机会我们再和大家分享。通过cffDNA的长度特征可以间接富集cffDNA，提高占比。2014年，卢煜明教授团队完成的一项新型NIPT研究中，就是对游离DNA的小片段区域进行独立分析，研究结果表明，该方法对T21和T18都达到了100%的准确性[7]。但是，如果只对更小片段的游离DNA进行统计，cffDNA的绝对数量也会同时减少[8]，所以，这是一把”双刃剑“。将来，如何更好的利用这些物理特征还需要等待科学家进一步研究。cffDNA的甲基化特征可能会使NIPT技术最为接近“理想状态“，比如，利用甲基化敏感的限制性内切酶降解母体cfDNA（图6）或在测序后，只对胎儿特异的甲基化DNA进行分析，以达到最大限度降低母体cfDNA干扰的目的。近年，利用cffDNA甲基化标志物进行了一些小规模回顾性研究，可能是检测技术方法的关系，检测灵敏度还有待进一步提升，不过随着测序技术的进步，相信一定会取得进展。

图6. 胎儿特异的甲基化基因可用于降低母体游离DNA干扰[9]

通过这篇文章只想让大家更好、更深入地了解NIPT技术的实施原理以及优势和局限性。NIPT不应该是一个被神化而且还遥不可及的技术，虽然技术本身操作繁琐，但它的原理很简单；虽然有复杂的统计算法，但它仍然依据一条一条游离DNA的数目。

很多时候，人们往往只注意到白板上的一个黑点，而忽视了整张白板。NIPT技术问世以来，使千万家庭避免了出生缺陷的悲剧发生，甚至提早发现了数十例母体中所存在的恶性肿瘤。由于NIPT可能会漏检像先天性心血管疾病等很多遗传综合征，目前的NIPT并不能完全替代标准的妊娠早期筛查，因此医生的专业素质尤为重要。同时，我们要明确无创产前诊断的目的是为准父母们提供生育选择，而不是阻止孩子的出生。如果不能理解这一诊断技术的正确目的将会传达一种歧视生命的错误信息。

参考资料：

1. Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood. PNAS 2008

2. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma. PNAS 2008

3. Noninvasive fetal genomic, methylomic, and transcriptomic analyses using maternal plasma and clinical implications. Trends in Molecular Medicine 2015

4. The potential of liquid biopsies for the early detection of cancer. Precision Oncology 2017

5. Noninvasive Prenatal Diagnosis of Fetal Chromosomal Aneuploidies by Maternal Plasma Nucleic Acid Analysis. Clinical Chemistry 2008

6. Maternal Plasma DNA Sequencing Reveals the Genome-Wide Genetic and Mutational Profile of the Fetus. Science Translational Medicine 2010

7. Size-based molecular diagnostics using plasma DNA for noninvasive prenatal testing. PNAS 2014

8. Analysis of the Size Distributions of Fetal and Maternal Cell-Free DNA by Paired-End Sequencing. Clinical Chemistry 2010

9. Hypermethylation of RASSF1A in Human and Rhesus Placentas. The American Journal of Pathology 2007

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