随着肿瘤领域转化医学研究的迅猛发展，肿瘤精准医疗的理念不断深入人心，NGS检测技术在肿瘤临床实践中的应用也越来越广泛。一时间，千树万树梨花开，涉足NGS肿瘤临床辅助诊断产业的公司不断涌现。在国内众多基因测序公司中，拥有新一代高灵敏度NGS建库技术平台的恒特基因脱颖而出，为业界所瞩目。作为一家发明PANO-SeqTM全景测序技术的公司，恒特基因的产品不仅对基因突变和拷贝数变异的检测具有更高灵敏度，而且在基因融合检测方面具有独到的优势。恒特基因对NGS在肿瘤临床医疗领域的应用有着怎样的理解和规划？对此，测序中国专访了恒特基因首席科学家郑宗立博士。在专访中，郑博士向测序中国详细介绍了基因融合检测在肿瘤诊疗中的重要意义，AMP和PANO-SeqTM技术解决的临床问题和产品动态，同时针对肿瘤早筛队列研究的试验设计发表了自己的看法，以下为采访实录。
测序中国：在肿瘤的诊断与治疗中，基因融合扮演了怎样的角色？
郑宗立博士：在开创肿瘤精准医疗时代和当前肿瘤靶向治疗的“横”向发展（异病同治）中，基因融合都扮演着打头阵的角色。基因融合也还是电影《我不是药神》里的基因主角。《药神》里的药—格列卫—是治疗BCR-ABL基因融合导致的慢性粒细胞性白血病的特效靶向药物，是肿瘤精准治疗的经典案例：54例经过阿法干扰素治疗失败的慢粒病人在接受了格列卫治疗后，53例血液学检查完全回归正常，这一结果是史无前例的，结果发表于2001年《新英格兰医学杂志》。
此外，在上海血研所原所长王振义教授的引领下，陈竺教授及其团队对阐明急性早幼粒细胞白血病发生的分子机制做出了重大贡献，并探索首创了用全反式维甲酸治疗急性早幼的历史。结合张庭栋教授用俗称砒霜的三氧化二砷“以毒攻毒”疗法，上海血研所在2001-2003年入组61例新发急性早幼病例的临床实验中表明二者的联合治疗可以治愈这个恶性度极高的癌症。我想强调一下，这里的效果是“治愈”，不像《药神》里的要持续吃药。这个临床实验的基因1号是PML-RARA基因融合，没有基因2号。陈竺教授获得过多项荣誉，包括今年4月由瑞典皇家科学院颁发的舍贝里奖（The Sjöberg Prize），现实版的英雄。
随着肿瘤精准医疗的发展，基因融合在肿瘤临床诊疗中的地位愈加重要。以发病率最高的肺癌为例，除了EGFR外，已获得美国FDA批准的治疗靶点—ALK和ROS1二者都是基因融合变异。
更令人振奋的是，今年的一项临床实验结果表明，针对17种不同肿瘤的广谱抗癌新药LOXO-101的治疗总体有效率为75％。异病同治：驱动肿瘤生长的基因决定治疗策略，且把器官和组织分型先放一边，这里的基因主角是NTRK1/2/3的基因融合。这17种肿瘤包括腮腺乳腺样分泌癌、各种肉瘤、婴儿纤维肉瘤、肺癌、黑色素瘤、胰腺癌、甲状腺癌、胃间质瘤、阑尾癌、乳腺癌、胆管癌和结直肠癌等，只要有NTRK1/2/3基因融合，就可以进行精准打击。
所以，基因融合检测在肿瘤精准医疗时代的重要性不言而喻。
测序中国：您多年来一直聚焦于NGS的临床应用，基因融合更是受到您特别关注，在不同肿瘤类型中，基因融合的存在范围与影响是怎样的？
郑宗立博士：是的，特别关注，因为对基因融合的分子诊断方法及生物信息算法的开发是我博士后导师交给我的第一个课题，是当时医院在肿瘤分子诊断方面遇到的一个难题。关于基因融合的存在范围，除了前面提到的一些历史发展的故事，为了了解其发生率，我们在完成了基因融合诊断平台AMP的开发之后，回顾性地分析了样本库里1500多例质量参差不齐的、不同组织来源的肿瘤石蜡样本(FFPE)，发现大约10%的肿瘤存在基因融合。这个比例与大型肿瘤研究（TCGA，主要是高质量的冰冻或新鲜组织）的全基因组测序发现的基因融合比例相近。
在未经选择的肿瘤病例中就有大约10%的基因融合，可以推断，在一些“选择过的”患者中，基因融合的比例会更高。例如肺癌，如果常规基因检测结果显示EGFR基因突变阴性，这时基因融合变异的可能性就要高于10%。
测序中国：临床应用的基因融合检测技术应该具备哪些条件？
郑宗立博士：从患者和临床医生的角度来说，最迫切的需求是如何能准确地发现肿瘤的治疗靶点。应用于临床检测的技术必须有高灵敏度和特异度。临床上最常见的样本是经福尔马林固定的石蜡组织块，也就是FFPE，样本的核酸（包括DNA、RNA）含量低，且断裂的比较严重。我认为不仅是基因融合的检测，所有的基因检测技术要尽力提高应对临床上质量参差不齐样本的能力，减少漏诊率。其次，基因检测尤其是基因融合检测的数据分析和检测报告要丰富全面，为医生和患者决定治疗方案提供有指导意义的信息。
测序中国：您发明的AMP技术，被业内称赞为突破基因融合检测的“金标准”，您认为AMP技术可以为肿瘤诊断、治疗解决哪些问题？
郑宗立博士：不敢说是什么突破金标准，没有最好，只有更好。首先，AMP技术以目的基因为靶点，进行360度全方位扫描，可检测靶基因与任何基因的融合，所以是科研利器。第二，AMP可以对质量低下的样品（短至60个碱基的RNA）进行检测，对各种质量参差不齐的标本具有广泛的应用性，适用于临床。第三，AMP使用的都是非常普通的分子生物学试剂，原料成本低。
一个相关的话题，用DNA还是用RNA来检测基因融合？其实，AMP技术使用RNA进行基因融合检测，是有多种原因的，可以对基因融合的结果进行质与量的判断。在肿瘤的NGS数据里有时可以看到很多的融合结果，其原因可能是肿瘤细胞的生物学行为，也可能是NGS文库制备过程中的人为因素。虽然变异发生在基因组DNA水平，但是通过细胞自身对preRNA的剪切过程可以去掉无意义的序列，且这部分序列往往具有长（需要的测序量呈十倍、百倍地增加）且其特异性低（造成了在数据分析时与基因组序列比对的不确定性、Mapping Quality低）的特征。
从RNA入手检测基因融合，不但克服了以上的缺点，还可以对融合的结果是否造成移码框错位进行分析，帮助判断其对细胞功能的影响，使检测结果更有价值。退一步来说，AMP技术也可以利用DNA进行融合检测，但是以DNA为基础的方法，不管是AMP还是常规的杂交捕获法，可以对付简单的基因融合（如检测ALK，测序量只是不到百倍的增加，但因省去了逆转录步骤，总体尚能接受），但对复杂的融合（如ROS1、NTRKs，测DNA是做百倍以上的无用功，且数据比对的质量不能保证）就很费劲了，有漏诊问题比较大。
临床标本质量参差不齐，FFPE标本中的RNA降解是普遍问题。开发AMP的过程中，我的导师给我一些连RT-PCR（目标产物是80bp大小的片段）方法都失败的标本（这博士后还做得下去吗？），有可能是标本质量太差，有可能是新的未知的融合伙伴。由于AMP只是单端锚定，另一端是开放的，所以对即使是断裂比较严重的小片段、即使是新的未知的融合伙伴，也能有效（类比杂交捕获）、且高效（类比PCR）地富集，综合杂交捕获与PCR两者的优势，提高临床应用的适用性。AMP的开发是在ALK（2010年《新英格兰医学杂志》）与ROS1（2014年《新英格兰医学杂志》）的故事之间完成的。
在美国和法国的其它几项研究中，比较了数种基因融合检测的方法，包括杂交捕获方法、AmpliSeq、FISH法、AMP等，结果表明AMP是较其它方法更灵敏、可靠的基因融合检测方法，该研究结果发表在2018年的JTO杂志上。
测序中国：AMP技术产品未来会有怎样的升级优化？目前还有哪些问题亟待解决？
郑宗立博士： 目前，恒特基因根据新一代的PNAO-SeqTM技术平台，正在设计一个产品系列—融合+，如肺癌的融合+（Lung Fusion+），能够实现基因融合检测全覆盖，包括肺癌中意义明确的基因融合，以及一些正在临床试验中，还未被FDA批准的融合，同时兼顾临床指导意义明确的SNV/Indel突变和拷贝数变异。这个全景测序平台在设计上是开放的：
- 对未知融合基因伙伴开放：不限定融合伙伴，不设壁垒，减少漏诊率；
- 对RNA和DNA开放：提取时我们跳过清除DNA或清除RNA的步骤，对其区分的工作留给最终的生物信息学处理。一次检测，单管完成融合、突变（SNV/Indel）、拷贝数变异、基因表达谱的检测；
- 对测序平台开放：不但兼容任何硬件测序仪，还兼容同一硬件平台内的各种型号，如兼容Illumina的MiSeq/NextSeq/HiSeq等各种不同的测序流程，且对有些流程的软件开发如提取UMI（2012年）是走在Illumina的官方软件之前的。
除技术和产品的升级优化，我们的技术要得到推广也有亟待解决的问题，我希望借助测序中国平台传递一下我的声音，希望未来的室间质评能够尽量从临床样品的可及性及检测需求出发，不断丰富标准品或质评标本的多样化，包括含有DNA和RNA的质评标本。
测序中国：2017年底，恒特基因推出了公司首个肿瘤基因检测PANO-SeqTM LBC Panel，拥有强大的基因融合变异检测功能，目前该产品的临床应用情况是怎样的？今年是否将有其他产品上市？
郑宗立博士：恒特基因正在利用PANO-SeqTM平台与一家知名三甲肿瘤医院合作，研究中国人群基因融合的种类与频率，同时检测panel临床应用的灵敏度和特异性等。到目前为止，除了常见的ALK、ROS1、RET等基因融合外，我们还检测到了一些罕见的基因融合。其中某些罕见融合美国已有报道，而且携有这些基因融合的患者在接受相应靶向治疗之后，肿瘤明显缩小（JCO Precision Oncology, 2017）。这恰好验证了PANO-SeqTM的灵敏性，具有重大临床意义。
今年，将要上市的有除针对肺癌的Lung Fusion+，恒特基因还将推出针对骨肉瘤和组织肉瘤的产品，以及针对血液肿瘤的产品。血液肿瘤和肉瘤中的基因融合十分多样，鉴别诊断是个临床上的难题，但是针对血液肿瘤基因融合的靶向治疗效果非常显著，如一开始提到开创肿瘤靶向治疗时代的经典案例。
测序中国：目前的检测产品都是针对某一种癌症，有没有可能设计一个检测产品可以检测多种癌症类型的不同基因融合呢？
郑宗立博士：这种产品设计在技术上可以实现，但是从临床适用的角度来看，针对性的检测panel更能提高临床效率。实体肿瘤的基因融合与血液肿瘤是完全不一样的突变谱；肉瘤与其他上皮源性肿瘤的突变谱也有很大差异，所以在基因融合方面，针对性的产品会更贴近临床的实际需要。
测序中国：前瞻性队列研究是为肿瘤的预防和早诊早治服务，那么在早筛的队列研究中需要注意哪些问题？
郑宗立博士：得肿瘤是运气不好（“bad luck”）的结果（Science, 2017）—这一结论在学术界引起了激烈的争论。在我看来，bad luck理论的论据是很令人信服的，细胞分裂次数多了，出错的概率就高。不能再生的组织，如心肌细胞从生下来多少就是多少，不再分裂增值，所以没听说过心脏癌吧（有童鞋说“生命在于运动”。。。呃，好吧）。当然，环境因素不可忽略，bad luck这项研究做了个估计，大概1/3的肿瘤是环境因素及遗传因素导致，有2/3是bad luck。且不论这个数值的准确性，肿瘤的二级预防，即早期筛查，亡羊补牢，为时不晚，虽然不像治疗个体那样把晚期病人的肿瘤缩小或消除来的那么强烈直接的感官刺激和兴奋，但是其社会意义重大，好比如传染病防制及疫苗的巨大成功后面是很多的无名英雄。
肿瘤的早筛，在基因检测之前，基于传统的检查方法我们已经实践很多年了，积累了宝贵的经验和教训。我希望有时间可以跟测序中国深入探讨这个问题，简言之，我相信大鱼是小鱼长大的，我们要寻找和干预的是小鲨鱼。时光不能倒流，你不知道当初被干预掉的是小鲨鱼还是无辜的小鱼。DNA变异是肿瘤不停分裂增殖的根，应抓住基因，认识本质。实践是检验真理的唯一标准，在人群筛查效果评估方面，有selection bias（选择偏移）, lead time bias（先导时段偏移）等等问题要考虑。恒特基因正在与中山市国家肿瘤早诊早治基地合作，基于健全的前瞻性队列开展前期研究工作，我希望下次可以有更多的数据跟测序中国分享讨论，谢谢!
尽管基因融合检测的临床应用困难重重，但随着技术的进步和科学家的不断努力，相信这些问题都会一一解决。郑宗立博士的AMP技术，与恒特基因新一代的PANO-SeqTM技术和检测产品，为融合基因的临床应用提供了精准有效的方法。希望在不远的未来，郑博士和恒特基因能够带给我们更多惊喜，让我们拭目以待。
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