目前，利用cfDNA进行癌症早期检测的研究备受关注。但鉴于高频突变数量有限，因此基于cfDNA的体细胞突变检测方法对早期癌症患者的敏感度可能较低。相比之下，针对癌症组织大规模表观遗传变化的检测方法则没有类似的限制，在癌症早期诊断和筛查领域具有广阔的发展前景。

2018年11月15日，国际顶级学术期刊Nature发表了一项液体活检最新重磅研究成果。来自加拿大玛格丽特公主癌症中心及多伦多大学的研究团队开发了一种基于免疫共沉淀的新型高通量cfDNA甲基化测序技术，名为甲基化cfDNA免疫共沉淀测序（cfMeDIP-seq）。该技术仅需几纳克DNA就能高灵敏度地检测cfDNA的甲基化特征，帮助研究人员早期发现癌症，还能鉴别不同癌症类型特有的DNA甲基化特征。

该研究由玛格丽特公主癌症中心Daniel De Carvalho博士领导进行。他认为，现有基于血液的癌症检测方法的敏感度和准确性还有很多不足，尤其是在早期癌症检测方面。为了突破现有血液检测技术的限制，De Carvalho博士研究团队作出了假设：将免疫共沉淀技术与高通量测序结合，通过对cfDNA中的甲基化DNA片段（富含CpG区域）进行特异性富集，以此提高检测效率。基于该假设，该研究团队开发了可分离、检测和分析低水平甲基化DNA的cfMeDIP-seq技术。

低上样量对于血浆cfDNA样本的检测应用至关重要，因为多数血浆样本cfDNA含量远低于100ng。研究团队优化了现有的低上样量的MeDIP-seq技术（上样量最低为100 ng）。经过优化，新型cfMeDIP-seq技术上样量可低至1~10 ng，并且可以重现MeDIP-seq（100 ng），简化甲基化测序（RRBS，1000 ng）和全基因组亚硫酸氢盐（WGBS，2000 ng）的检测概况，表明该检测的准确性与其他检测方法水平相当。

此外，与MeDIP-seq相比，cfMeDIP-seq在结直肠癌cfDNA甲基化检测中表现出更强大的检测重复相关性。由于结合了免疫共沉淀技术，其CpG富集效果可达到上样前的2倍（图1b,1c）。同时，研究人员还将cfMeDIP-seq与超深度杂交捕获突变测序进行了比较，发现cfMeDIP-seq在ctDNA检测中有着较高的灵敏度。

图1. b：将HCT116 DNA掺入MM.1S多发性骨髓瘤DNA，利用cfMeDIP-seq与MeDIP-seq观察到的甲基化信号和预期的检测结果具有良好的相关性。c：使用cfMeDIP-seq检测结肠直肠癌患者以及患者来源异种移植物（PDX），比较上样前与上样后（IP）ctDNA（人）占血浆总cfDNA（人+小鼠）的百分比变化。

为了解cfMeDIP-seq在实际应用中的检测能力，研究团队进行了对照检测试验。通过检测24名早期胰腺癌患者与24名健康人的血浆cfDNA，研究人员共找到了14716个不同的甲基化修饰区域，其中来自癌症患者有9931个，对照中有4785个。通过检测两组参与者的组织样本，研究人员还获得了45173个差异甲基化CpG。随后，研究人员将检测到的甲基化区域与TCGA数据进行了对比，发现这些区域在肿瘤组织中呈高甲基化，该研究结果进一步强化了根据cfDNA追踪肿瘤DNA的假设。

此外，研究人员分析发现，cfMeDIP-seq可以通过检测DNA甲基化特征，从健康对照中区分24名早期胰腺癌患者。通过检测来自7种不同肿瘤类型（急性髓性白血病，胰腺癌，结肠直肠癌，乳腺癌，肺癌，肾癌和膀胱癌）的388个样本，该检测方法还可以通过识别特定的甲基化特征区分癌症类型。

图2. cfMeDIP-seq检测来自7种不同肿瘤类型的样本：PDAC，AML，BLCA，BRCA，CRC，LUC和RCC，包括早期和晚期肿瘤，以及健康对照。对于每种癌症类型，鉴定了癌症类型和正常对照之间的DMR。

事实上，该研究团队并不是唯一一个研究早期癌症甲基化检测或其他表观遗传变化的团队，该领域的很多商业化公司也将甲基化检测纳入了研究范畴，如Grail，Freenome，莱盟君泰和鹍远基因等公司。但由于血浆cfDNA的丰度较低并且碎片化程度较高，相关检测研究仍存在较大的挑战。虽然有科学家尝试利用WGBS进行甲基化的检测，但遗憾的是亚硫酸盐转换会导致约84-96%的DNA损伤和降解，并且在成本、信息覆盖和检测效率方面并不尽如人意。因此，开发一种敏感度高、准确性好的cfDNA甲基化检测技术对癌症早筛等研究都有十分重要的意义。

该研究结果表明，cfDNA甲基化特征检测作为非侵入性手段，在早期肿瘤检测的敏感度、准确性、成本效益以及癌症分类等方面都有巨大的发展潜力，并有望带来一种非侵入性、高灵敏度的低成本早期癌症检测手段。虽然cfMeDIP-seq技术还需要在独立样本中进行验证，但该研究仍有助于新的非侵入性癌症筛查检测方法的研发。

近年来，国内外科学家在液体活检研究领域做了大量的尝试与创新，多种新型液体活检技术在知名学术期刊发表。美国加州大学圣地亚哥分校的张鹍教授发明的液体活检技术，以DNA中甲基化的CpG岛作为特定的检测标签，通过检测ctDNA就可检测癌症，还能确定肿瘤的生长位置。美国加州大学圣地亚哥分校医学院张康教授研究发现，DNA甲基化可为4大癌症提供有效标记，不仅能区分肿瘤组织和正常组织，还能揭示患者预后和生存等信息。相信随着检测技术的不断革新，未来通过无创的方式检测早期癌症或将成为现实。

参考资料：

1. Methylation-Based Cancer Early Detection Method Shows Promise in Preliminary Studies

2. Sensitive tumour detection and classification using plasma cell-free DNA methylomes