近日，多项与液体活检相关的重要研究成果陆续公布，让人大呼过瘾。英国剑桥大学科学家通过体外富集一定长度的cfDNA来提高ctDNA分析准确性（Science Translational Medicine）；卢煜明教授团队发现，ctDNA片段除了长度偏小之外，其末端位置也同样具有一定特征（PNAS）；加拿大研究团队另辟蹊径，利用新型的cfMeDIP甲基化检测技术，在小样本中实现了某些癌症的早期准确诊断（Nature）。除此之外，还有两项里程碑式的成果，斯坦福大学的Howard Y. Chang教授团队绘制了目前最为全面的癌症染色质可及性图谱（Science）；Nature Biotechnology也报道了一种可以克服Bisulfite损伤的新型表观修饰检测技术——ACE-seq。

ctDNA是来自肿瘤基因组的碎片，其在癌症诊疗中的作用无需多言。目前，我们已经发现了ctDNA的多个特征（图1），并将其分为两类：一类是在基因组层面；另一类属于表观层面，例如核小体占位（Size/End）和碱基修饰（甲基化、羟甲基化等）。不难发现，上述研究其实都聚焦在表观组学标志物上。那么，表观标志物与基因组标志物的研究有什么不同？这些研究的出发点是什么？又想解决哪些问题？为了回答这些问题，小编总结了几个关键词：Size selection、PCR-free和Single cell和BS-free。接下来，我们就围绕这些关键词，系统地回顾一下上述研究的来龙去脉。

图1. 肿瘤特异的基因组和表观组学标志物[1]

对于Size selection，为什么要进行片段分选？因为此前研究发现，与正常细胞的cfDNA相比，ctDNA会普遍小一些。通过体外实验手段，研究人员富集了ctDNA片段分布最为集中、cfDNA浓度较低的区域，以此提高ctDNA的相对浓度（90~150bp），并利用富集后的DNA分析ctDNA的CNV和SNV，进而大大提高了准确性[2]。

图2. 体外Size selection提高ctDNA的CNV灵敏度[2]

不过，需要注意的是，对cfDNA进行体外筛选可能会导致样品污染，这也是不少研究人员的顾虑[6]。此外，从图3我们可以看到，片段分选在本质上是以牺牲部分ctDNA为代价来提高其相对浓度。所以,研究人员也在报道中强调，体外筛选可能会导致某些ctDNA信息的丢失[2]。而早期肿瘤的ctDNA少之又少，因此是否进行体外选择仍需慎重。

图3. cffDNA和ctDNA的片段分布特点[2,5]

一个有意思的问题是，cffDNA和ctDNA为什么都会偏小？研究人员一般认为，如果核小体上的DNA缠绕变得松弛，核酸内切酶就更易接近并发生剪切，也就产生了更小的DNA片段[8]，这也在一定程度上反映了染色质的开放程度，暗示着更高的转录活性（图4）。

图4. 白细胞和胎盘组织的ATAC-seq结果以及核小体DNA切割示意图[8]

实际上，在很多年以前，科学家们就已经通过分析Y染色体序列（cffDNA）或少数携带体细胞突变的片段（ctDNA），分别观测到cffDNA和ctDNA的片段长度更短的现象[3,4]。在高通量测序技术（NGS）出现后，科学家才进一步确认了这一现象，并尝试用于NIPT和液体活检[2,5,6,7]。那么，究竟是哪些因素限制了cfDNA片段特征的研究呢？

通常，我们先利用体细胞突变区分ctDNA和cfDNA，然后再去观测这些ctDNA的片段分布。而问题恰恰就出在了体细胞突变上，主要是由于体细胞突变鉴定方法的限制。“UMI-PCR+Panel+超高深度测序”这套技术是体细胞突变鉴定的常用方法，鉴定到的突变自然而然也只能出现在Panel的基因中。这种利用基因Panel探索基因组标志物，进而开展表观修饰研究的思路便存在一定局限性。换句话说，我们只能标记并观测非常局部的ctDNA片段（图5）。

图5. 技术的进步让我们开始观测到全基因组范围的体细胞变异（冰山底部）[9]

在不借助UMI-PCR的情况下，如何矫正测序错误并权衡成本，实现全基因组的低频突变鉴定呢？卢煜明教授团队发现ctDNA偏好末端，正是得益于一种全新的Error-corrected NGS技术——“PCR-free+WGS+动态阈值分析”[11]。该技术首先在cffDNA片段末端研究中崭露头角[10]。研究人员借助PCR-free技术矫正PCR错误，利用高深度WGS测序（195~270x）配合动态阈值分析去除测序仪错误后，他们惊奇地发现，cffDNA的片段除了长度更短之外，往往还具有相同的末端位置（图6）。PCR扩增是测序数据偏好的主要来源，研究人员认为，此前之所以没有观测到这一现象，主要因为PCR偏好掩盖了真相；同时，研究中测序的深度也是之前研究从未达到的。

图6. “PCR-free+WGS+动态阈值”分析技术探究cffDNA片段特征[10]

现在，他们将这套检测方法运用到了肝癌的ctDNA分析中。果不其然，ctDNA也具有明显的偏好末端[11]。值得注意的是，相较于常规UMI+Panel的ctDNA鉴定方法，全新的Error-corrected NGS技术进一步扩大了突变的筛选范围，使得偏好末端或size标志物观测不仅仅局限于肿瘤的突变热点基因区域。最终，研究人员发现了大量ctDNA的偏好末端。这些偏好末端主要出现在基因间区（58%）和基因区（39%）[11]，这使开发更为经济的综合性ctDNA检测技术成为了可能。

对于cfDNA片段标志物的筛选，上述研究可以理解为顺藤摸瓜、追本溯源的鉴定方式，即从已经被切割成cfDNA的片段中找寻规律。但现在，我们还没有足够的标志物能够精确地将不同组织来源的cfDNA统统区分开来，所以也不能清晰地分析出它们在血浆中的特征。实际上，回到组织源头，每种组织甚至每个细胞都具有独特的表观调控模式，肿瘤内部的异质性更是将表观特征的多样性推向了极致。所以，通过Single cell表观测序分析，更为真实地还原肿瘤细胞群特有的全景表观调控模式，将为我们理解血浆中ctDNA的片段特征提供更多的参考（癌症染色质可及性图谱，Science）。似乎，科学家们已经开始探索冰山底部的秘密了（图5. PCR-free Error-corrected WGS/Single-cell ATAC-seq）。

有趣的是，最后的两项研究很有缘分，他们都不约而同地向着同一个目标进发——BS-free（图7）。在癌症甲基化早筛研究中，Bisulfite俨然成为了“全民公敌”，BS-free技术也一直是研究者梦寐以求的“神器”。在题为“Sensitive tumour detection and classification using plasma cell-free DNA methylomes”的Nature文章中，研究人员通过加入carrier DNA提升了IP效率，使得优化后的cfMeDIP技术可以对cfDNA实现BS-free检测；Nature Biotechnology报道的ACE-seq则是利用酶学转化原理替换Bisulfite的化学转化。两篇文章可谓具有异曲同工之妙。

图7. 两种检测DNA表观修饰的BS-free技术[12,13]

目前，表观修饰研究大多遵循两种思路：一种是基于识别甲基化DNA的抗体或结合蛋白，不需要对DNA进行额外的处理；另一种，是需要加入示差试剂对DNA进行处理，以区分C和mC，比如“万恶”的Bisulfite。在小编看来，两种方法各有优劣。前者过于依赖抗体的性能，也不能达到单碱基分辨率，但他最大的优势就是无伤，这恰恰是后一类方法的痛点。而ACE-seq可谓在千呼万唤、万众期盼的情形下登场的。基于酶学处理的ACE-seq可将DNA的损伤降到最低，在提升检测灵敏度的同时，还保留了DNA的完整性，利于检测cfDNA的其他特征。ACE-seq不论是在组织、单细胞，还是游离DNA的表观修饰分析中，都具有非常广阔的应用前景。

近期的多项研究进展确实令人振奋，这也使我们离真相越来越近。但科学家们仍清楚地认识到，人类对肿瘤基因的认知还仅仅是冰山一角。就像最近Nature Review Genetics综述中提到的[1]，我们现在连cfDNA的真实组成都还没有完全确认。它们真的主要来源于白细胞吗？如果不是，使用白细胞作为背景突变对照可能是存在漏洞的。此外，之前爆出的不同检测机构的肿瘤基因检测结果差异巨大，到底是肿瘤异质性的真实反映还是技术的限制？在真正“驯服”ctDNA之前，我们仍有很多基本的生物学问题尚待回答。

参考文献：

1. Current and future perspectives of liquid biopsies in genomics- driven oncology. 2018NRG

2. Enhanced detection of circulating tumor DNA by fragment size analysis. 2018 Science Translational Medicine

3. Size Distributions of Maternal and Fetal DNA in Maternal Plasma. 2004 Clinical Chemistry

4. Detection and quantification of mutations in the plasma of patients with colorectal tumors. 2005 PNAS

5. Maternal Plasma DNA Sequencing Reveals the Genome-Wide Genetic and Mutational Profile of the Fetus. 2010 Science Translational Medicine

6. Fragment Length of Circulating Tumor DNA. 2016 Plos Genetics

7. Size-based molecular diagnostics using plasma DNA for noninvasive prenatal testing. 2014 PNAS

8. Size-tagged preferred ends in maternal plasma DNA shed light on the production mechanism and show utility in noninvasive prenatal testing. 2018 PNAS

9. Aging and the rise of somatic cancerassociated mutations in normal tissues. 2018 Plos Genetics

10. Second generation noninvasive fetal genome analysis reveals de novo mutations, single-base parental inheritance, and preferred DNA ends.2016 PNAS

11. Preferred end coordinates and somatic variants as signatures of circulating tumor DNA associated with hepatocellular carcinoma. 2018 PNAS

12. Sensitive tumour detection and classification using plasma cell-free DNA methylomes. 2018 Nature

13. Nondestructive, base-resolution sequencing of 5-hydroxymethylcytosine using a DNA deaminase. 2018 Nature Biotechnology