2月28日，Science在线同期发表了两篇基因编辑研究文章，中国科学家首次发现单碱基编辑也存在严重的脱靶效应，同时，还报道了中国科学家开发的新脱靶检测技术GOTI。

传统基因编辑系统是利用Cas9酶切割DNA两条链，使目的基因失活或插入新的DNA片段。在单碱基编辑系统中，仅有一条DNA链被切割，且仅将一个碱基转变成另一个碱基。相比之下，单碱基编辑系统更加容易控制，因此研究人员没有预料到这会导致脱靶效应。

遗憾的是，在Science发表的两项最新研究中，中国科学家利用不同方法，在小鼠和水稻的独立研究中，发现CBE编辑器（C to T）可导致大量脱靶突变，并且这些脱靶大多出现在此前脱靶预测认为不太可能出现的位点，或存在严重的安全风险。与此同时，中国科学家还开发了一种新的脱靶检测技术GOTI（Genome-wide Off-target analysis by Two-cell embryo Injection）。GOTI能够精准、灵敏地评估基因编辑的脱靶效应，为该技术的安全性评估提供了一定的技术保障。

在水稻研究中，中国科学院高彩霞课题组利用不同基因编辑系统对77株植物进行了试验，包括BE3 (基于融合rAPOBEC1胞嘧啶脱氨酶的CBE系统)、HF1- BE3（高保真BE3）与ABE单碱基编辑系统，并在全基因组水平，将其DNA与对照植物进行了突变比较。

研究发现，BE3与HF1-BE3可在水稻基因组中产生大量单核苷酸变异。与对照组相比，C to T单核苷酸变异分别增加了94.5%和231.9%。同时，研究人员意外发现，BE3与HF1-BE3产生的部分单核苷酸变异无法用现有软件预测。试验中，ABE系统表现出非常高的特异性，试验组与对照组SNV数量基本一致。表明BE3和HF1-BE3系统可在植物体内造成难以预测的脱靶突变，使全基因组脱靶突变水平翻倍。

高彩霞表示：“对于这个结果我们感到非常惊讶也感到担心，我们必须非常非常小心，保证结果的准确性，因为整个世界都将密切关注。幸运的是，另一项利用小鼠进行的独立研究，也得到了非常相似的结果。”

高彩霞口中的另一项独立研究，由中科院神经科学研究所、上海脑科学与类脑研究中心杨辉课题组等研究团队合作完成。为了研究全基因组范围内基因编辑可能产生的脱靶效应，该研究团队开发了一种新的脱靶检测技术GOTI。借助GOTI研究人员发现，部分单碱基编辑有可能产生大量无法预测的脱靶突变。这与高彩霞研究团队的研究结果一致。

为研发GOTI，提高检测脱靶效应的精度，需要设置严格的对照组来确定突变位点。研究人员颠覆了原有的脱靶检测手段，选择在小鼠受精卵二细胞期时，对其中一个卵裂球进行了基因编辑，并利用红色荧光蛋白进行了标记。在小鼠胚胎发育到14.5天时，对整个胚胎进行单细胞全基因组测序。这样两组细胞的遗传背景一致，并避免了体外扩增的噪音问题。只要根据荧光标记区分基因编辑细胞和对照细胞，就可以评估基因编辑的脱靶效应。结果显示，GOTI技术灵敏度较高，可以精准地展示单核苷酸突变，包括极少数的脱靶突变。

GOTI工作流程

借助GOTI，研究团队检测了经典的CRISPR/Cas9系统和单碱基编辑系统BE3和ABE。研究结果显示，设计良好的CRISPR/Cas9并没有明显的脱靶效应。ABE系统也表现出非常高的特异性，但BE3存在非常严重的脱靶问题，有引发癌症的潜在风险，并且这些脱靶突变大多出现在此前认为不太可能出现脱靶的位点。

自基因编辑技术问世以来，脱靶效应一直是其绕不过去的话题。虽然科学家们开发了多种脱靶检测技术，但这些技术都有一定的局限性，无法高灵敏度的检测随机脱靶位点。GOTI技术可以在不借助于任何脱靶预测技术的情况下，发现此前无法预测的随机脱靶位点，为基因编辑的安全性评估提供了技术支持。

哈佛大学David Liu教授表示：“总体来说，目前这些脱靶效应仍然很少见，并且不太可能干扰实验室中基因编辑技术的使用。但可能产生的后果足以让患者对该技术的临床使用感到担忧。”2016年，David Liu及同事在Nature首次报告了胞嘧啶单碱基编辑系统（CBE），可将C-G碱基对替换为T-A碱基对，首次实现在不引入DNA双链断裂的情况下进行单碱基的替换。2017年，该研究团队再次报道了新的腺嘌呤碱基编辑器（ABE），能将A-T碱基对转换为G-C碱基对。

首尔国立大学的研究员Jin-Soo Kim认为：“这两项研究非常有趣并且非常重要。目前，最重要的是我们要确定哪种成分导致了脱靶效应，以及如何减少或避免这些错误的基因编辑。”有专家认为，调整单碱基编辑的脱氨酶或其他组分或许可以减少脱靶效应。也有专家表示，新技术必然会存在一些问题，这些研究并不会削弱科学家对单碱基编辑的热情。

因为能够精确地改变单个碱基，定向编辑、矫正基因变异，单碱基编辑在罕见遗传病的研究治疗中有着重要的应用前景。尽管如此，脱靶效应仍然是基因编辑无法回避的一个问题。新的研究成果表明，单碱基编辑也存在无法预测的脱靶风险，我们还需要慎重对待。安全的检测技术有助于安全的基因编辑技术的开发，只有经过仔细验证的基因编辑技术才有可能应用于临床，为人类疾病研究做出贡献。

参考资料：

1.CRISPR offshoot still makes mistakes editing DNA, raising concerns about its medical use

2.Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice

3.Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos