2016年，FDA批准了第一种基于血液样本的癌症基因检测技术，用于检测非小细胞肺癌（NSCLC）中的EGFR基因突变，开创了液体活检新时代。在NSCLC中，EGFR基因的突变频率非常高，明确EGFR基因状态对指导NSCLC患者后续靶向用药治疗至关重要。在大型癌症研究中，由于组织活检NGS检测方法的失败率约为14％，无法满足临床需求。有科学家认为，将液体活检、NGS与机器学习结合起来的检测方法极有可能弥补组织活检的不足，帮助指导癌症患者的治疗选择。

近日，来自Memorial Sloan Kettering癌症中心，MD安德森癌症中心和Dana-Farber癌症研究所的科学家与Illumina、Grail两大公司的研究团队，联合开发了一种检测NSCLC基因突变的新液体活检方法——超深度cfDNA NGS分析方法（Ultra-deep next-generation sequencing of plasma cfDNA）。该方法可检测晚期NSCLC的多个驱动突变靶点和耐药突变，具有较高的灵敏度和特异性。在某些情况下，该方法可在组织活检数据不足以进行分析时起到关键作用。近日，相关研究成果发表在Annals of Oncology上。

据悉，该液体活检方法使用了Illumina的“超深度NGS”技术。研究人员可利用覆盖37个肺癌相关基因的混合捕获panel，对血浆cfDNA和白细胞进行超深度NGS测序，测序深度为50,000×，可检测低频变异。同时对白细胞进行测序以过滤“克隆性造血”等非癌症信号。获得的测序信息最终通过Grail开发的机器学习算法来确定驱动突变。

图：超深度NGS靶向检测cfDNA的工作流程

研究中，科学家对127名晚期转移性NSCLC患者进行了基因检测。患者共分为3组，第1组为基于组织基因分型的已知癌症驱动突变的患者；第2组为组织NGS检测驱动突变阴性的患者；第3组为组织检测数据不足或未知驱动因素的患者。研究人员对已知致癌因素血浆检测的临床敏感性和特异性进行了计算，与组织基因分型结果进行了比较，并对一组NSCLC患者进行了正交ddPCR验证。

研究发现，该方法能够检测等位基因频率为0.14%的变异，基于cfDNA的基因分型大多数情况下与组织活检的基因分型一致。研究数据显示，有91名患者通过组织活检发现了癌症驱动基因突变，利用超深度cfDNA NGS分析方法可检测出其中的68名患者，真阳性率为75%。

领导该研究的MSK医学肿瘤学家Bob Li表示：“在19名组织活检未发现突变的患者中，超深度cfDNA NGS分析方法也没有发现任何异常，这意味着该方法没有假阳性，真阴性率为100%。”

图：在肿瘤组织和血浆中检测到驱动突变或抗性突变的患者数量以及敏感性和特异性。

同时，研究人员还在肿瘤组织被认为不足以进行基因分型的17名患者中检测了该方法。经过检测分析，超深度cfDNA NGS分析方法确定了其中4名患者的KRAS突变，并有1名患者通过组织活检得到确认。此外，在23例获得性耐药EGFR突变的患者中，新液体活检方法可检测到多个耐药突变，包括EGFR T790M和C797S突变和ERBB 2扩增。

Bob Li表示，75%的检出率表明该方法可能仍需要进行组织活检。但为了更早制定治疗方案，可以先做液体活检。因此，当传统组织活检不可行时，液体活检也可能成为一个有价值的替代方案。

该研究结果表明，在肺癌治疗方面，超深度NGS液体活检可以在组织活检中发挥重要的辅助作用，检测NSCLC中广泛的驱动突变和耐药突变，在组织活检数据不足的情况下进行基因分型。为支持血浆NGS检测的潜在临床应用价值和cfDNA在肺癌治疗、干预研究中的临床有效性提供了有效证据。

科学家们一直在探索提高液体活检灵敏度的新方法。为了早期发现多种类型的癌症，Grail正在努力开发高灵敏度的血液检测方法。在2018年6月的ASCO会议上，Grail展示了其循环无细胞基因组图谱（CCGA）项目的数据。研究数据显示，其液体活检方法在肺腺癌、鳞状细胞肺癌和小细胞肺癌的检出率为59％~92％，假阳性率小于2％。

目前，一些液体活检技术主要通过检测cfDNA来识别致癌突变，帮助、指导医生选择治疗方案。但经美国临床肿瘤学协会和美国病理学家学院的联合审查，结论是目前将cfDNA应用于常规临床检测还为时尚早，各项研究都有自身的局限性，仍需进行反复验证。该研究创造性的将液体活检、NGS和机器学习相结合，为癌症治疗研究提供了新的思路。希望随着测序技术的进步，科学家能够开发出更多灵敏的检测方法，使液体活检能够惠及更多的癌症患者。

参考资料：

1.Ultra-deep next-generation sequencing of plasma cell-free DNA in patients with advanced lung cancers: results from the Actionable Genome Consortium

https://academic.oup.com/annonc/advance-article/doi/10.1093/annonc/mdz046/5390576

2. A liquid biopsy that combines Illumina’s ‘ultradeep’ sequencing with Grail’s machine learning

https://www.fiercebiotech.com/research/combining-illumina-s-ultra-deep-sequencing-grail-s-machine-learning-liquid-biopsy

3. Illumina-Sponsored Study Finds Liquid Biopsy Complements Tissue-Based Genotyping in Lung Cancer

https://www.genomeweb.com/liquid-biopsy/illumina-sponsored-study-finds-liquid-biopsy-complements-tissue-based-genotyping-lung#.XJxp6SJ742w