随着单细胞RNA测序技术近年来的迅猛发展，如今研究人员正在试图了解各种单细胞测序方法的优点和局限性。近日，来自Broad研究所的团队对7种单细胞RNA测序方法进行了比较，并希望以此为其他研究人员提供指南，并作为衡量新技术的标准。

论文通讯作者、Broad研究所高级组长Joshua Levin表示，这项评估将有助于Broad研究所为单细胞RNA-seq研究选择技术，包括“人类细胞图谱计划”等项目。此外，由于研究人员使用的均为常用的样本类型，并且开发了一种适用于所有方法的生物信息学流程，因此可以直接对新技术或现有技术的升级版进行评测。相关文章于近日发表在BioRxiv。

“我们想了解每种方法的优缺点。”Joshua Levin说，“我们还希望以不同的方式进行比较，不仅观察技术方法，还要了解每种方法所捕获的生物学信息。”他认为，虽然早期研究已经比较了基因组学方法，但是单细胞基因组学是一个快速发展、充满活力的领域，因此对最新技术进行评估将十分重要。例如，就在上月，来自美国密歇根大学的团队便开发了一种名为“Hydro-seq”的单细胞RNA测序方法。该方法可以在微流体设备中收集循环肿瘤细胞（CTC），然后将这些细胞用于表达分析。虽然Broad研究所的本次研究中没有涵盖该方法，但最终也可以通过相同的方式对Hydro-seq方法进行基准测试和比较。

回到本项研究中，Broad研究所共计评估了七种方法，包括两种低通量方法Smart-seq2和CEL-Seq2，以及五种高通量方法，包括10x Genomics公司开发的Chromium单细胞基因表达解决方案、基于微流体的Drop-seq方法、美国麻省理工学院开发的Seq-Well方法、1CellBio公司商业化推广的inDrop方法，以及美国华盛顿大学开发的sci-RNA-seq的组合型索引策略。研究人员利用这些方法对混合细胞系、外周血单核细胞（PBMCs）和小鼠脑组织细胞进行了分析。此外，研究人员还测试了四种方法分析细胞核RNA的能力。研究人员共构建了36个不同的文库，从约92000个单细胞中生成了表达数据。

Levin表示，总的来说，所有方法都取得了成效。“每种方法都有自己的优势，所以我不能随便说应该用哪一种，这不是我要传递的信息。但是，有些方法在不同方面表现得更好。”例如，较低通量的方法通常有更好的敏感性，能够在每个细胞中检测到更多基因。Smart-seq2方法能检测来自整个转录本的reads，而不仅仅是3'末端的，因此如果研究人员对RNA可变剪接异构体感兴趣，那么他们可以选择这种方法。

在这项研究中，研究人员分析了许多不同的指标，包括敏感性、reads分布和多态率（每次捕获1个以上细胞的概率）。与预期一致，较低通量的方法更敏感，能够检测每个细胞最独特的分子标记和基因。10x Chromium则在高通量方法中具有最高的灵敏度，而inDrop灵敏度最低。

研究人员还分析了每种文库类型的reads分布，为每种方法的有效率提供了信息。例如，该团队分析了每个文库在预期位置不含polyT的reads的比例。一般来说，他们发现未使用磁珠捕获mRNA的方法（CEL-Seq2和sci-RNA-seq）以及10x Genomics方法，在预期位置具有polyT，而Drop-seq、inDrop和Seq-Well方法在预期位置更多分布的是不含有polyT的reads。通过观察reads分布，研究小组发现，Smart-seq2和inDrop的reads分布在外显子区的比例最高，超过50％；而sci-RNA-seq的分布于外显子区的reads最低，低于30％ 。此外，当分析血细胞和细胞系时，所有方法测到的reads分布在外显子区域的比例都较低。

为了计算多态率，研究人员分析了人类和小鼠细胞系混合物的数据。因为两个物种都带有细胞条形码，因此研究人员可以通过这些数据计算这些方法何时捕获了多个细胞。分析显示，除inDrop之外所有方法的多态率都低于3.5％。低通量方法Smart-seq2和CEL-Seq2的多态率低于1％，作者认为这是因为这些方法使用了FACS对细胞进行分类。

除了分析这些方法的技术参数外，研究人员还对这些方法在捕获生物学信息方面的能力进行比较。单细胞RNA测序的主要应用之一是鉴定不同的细胞类型。为了分析这些方法鉴定细胞类型的能力，研究人员分析了来自血细胞和小鼠皮质的数据。在比较过程中，研究小组提取了每个细胞中相同数量的reads，并从每种方法中分别对相同数量的细胞进行了采样。一般而言，这些方法在分离转录相似的细胞上具有一定的难度，然而，10x Genomics和inDrop方法在这方面优于其他方法。同时，所有方法都能很好地回收较为丰富的细胞类型。但对于较低通量的方法，无法分析足够的细胞来收集稀有细胞类型。在观察小鼠皮层细胞时，只有DroNc-seq（一种设计用于细胞核的Drop-seq版本）能够捕获到罕见的周皮细胞。DroNc-seq、10x Genomics和Smart-seq2检测能力相似，但各自在检测某些细胞类型时能力略有不同。

Levin表示，除了分析这些方法本身之外，这项研究的一个重要部分是开发一款适用于所有测序方法的生物信息学分析流程。为此，Broad研究所团队开发了一个名为“Scumi”的工具。他介绍，尽管每种测序方法都有各自的计算工具，但他们认为，使用一种通用分析方法来比较不同测序方法，能够最大限度地减少由生物信息学差异引起的差异。“令我感到惊讶的是，进行一项公平的比较竟然这么困难。”同时，平衡优化计算流程是非常棘手的，因为只有这样，才能使每种方法都能够以最佳性能运作，而不会对任何其他方法产生偏倚。

对于这项研究，Sanger研究所单细胞基因组学实验室负责人Roser Vento-Torma也给予了高度评价：“这种类型的研究是十分有必要的，因为它们以公平的方式比较了不同方法。”她同意计算流程是该研究的重要组成部分，同时这将能够帮助其他研究人员使用相同的手段对其他测序方法进行比较。“这些类型的分析确实很难做到。”她补充道，因为所使用的生物信息学工具会对结果产生非常大的影响。尽管Broad研究所团队的结果在一定程度上与之前研究的结果一致，但它在多种样本类型（包括生物数据）中比较了测序方法，还使用统一的生物信息学方法进行比较，这些都比以往研究更进了一步。

这项研究并非首次尝试比较单细胞测序方法。例如，去年清华大学生命学院王建斌研究组和北京大学BIOPIC黄岩谊研究组以及上海交通大学附属瑞金医院刘峰研究员就曾在Molecular Cell文章中对液滴型单细胞RNA测序方法进行了比较，Sanger研究所的研究人员也一直在比较各种单细胞RNA测序方法和测序平台。Roser Vento-Torma认为，因为这些类型的基准研究可能非常昂贵，较小的实验室无法轻易实施，因此这些数据在公共领域非常有价值。

参考资料：

1. Systematic comparative analysis of single cell RNA-sequencing methods

2. Broad Institute Team Aims to Benchmark Single-Cell RNA Sequencing Technologies