近年来，基于个体化分子图谱的癌症精准治疗已经取得了令人瞩目的成绩，越来越多的研究表明，癌症患者特异性的分子标志物可以用来指导患者的精准用药及临床试验的入组。目前，绝大多数的精准医疗策略仍然基于FFPE或新鲜冻存肿瘤组织样本进行基因组的测序，然而基于这种类型的样本通常会面临这些挑战：FFPE样本无法体现肿瘤的持续进化，特别是耐药性的获得；肿瘤组织含量少、异质性高；样本的年龄差异大、质量差等问题。另一方面，虽然基于循环肿瘤DNA（ctDNA）的NGS技术也可以对血液进行基因组分析，但尚未在I期临床试验中被常规应用。

今年4月，来自英国国家癌症中心、曼彻斯特大学、AstraZeneca等机构的研究者在Nature Medicine期刊上发表了TARGET（Tumour chARacterisation to Guide Experimental Targeted therapy）项目第一期的研究结果，对以不同类型晚期癌症患者的ctDNA代替肿瘤组织，帮助早期临床试验进行患者选择的可行性进行了评估。TARGET是一项由英国癌症研究中心等机构资助的分子分析项目，共分为两个阶段：TARGET项目第一期共入组100位患者，并建立了一套完整的实验和分析流程；第二期将入组450位患者测试临床效果，目前仍在进行中。

图1. TARGET项目ctDNA和肿瘤分析框架图

值得关注的是，为了保障该研究项目的顺利开展，研究者引入了一套从样本制备到数据分析和解读的完整解决方案，进而对整个流程的可靠性、报告周期、成本及临床可行性进行评估。在前期的游离核酸提取步骤，研究团队采用了QIAGEN公司的QIAsymphony Circulating DNA Kit结合经典的QIAsymphony自动化工作站，帮助实现高质量、高通量的核酸提取。在数据分析环节，为了保证检测到体细胞突变的可信度，研究者还引入了QIAGEN桌面化数据分析工具CLC Genomics Workbench。此外，研究者将CLC Genomics Workbench和MuTect以及CLC Genomics Workbench 和VarScan检测到的变异位点交集作为高可信的体细胞突变，并将AF阈值设置为2.5%。

图2. QIAsymphony游离核酸自动化工作站（左）；桌面化NGS数据分析工具CLC Genomics Workbench（右）

如何对最终获得的大量体细胞突变进行治疗（treatment）、临床试验（clinical trial）和预后（prognostic）的匹配、注释和评估，一直是业界的一大挑战。这需要“分子肿瘤专家委员会”（Molecular Tumor board，MTB）专家能够紧跟获批的新药信息（一个月有1~3个癌症药物获批）、药物对应适应症的变化、指南的更新、临床试验的招募和停止（平均一个月有250个临床试验开始，140个临床试验停止）、快速增长的研究文献等信息。

论文作者在文章中提到：“过去，在基于分子图谱进行的大型临床试验患者筛选研究项目中，之所以最终只有10%~15%的患者能够纳入研究，一个可能原因是对于未知变异位点的解读能力有限。任何MTB专家都不可能掌握所有变异位点的相关知识，而且相关的数据库也都在持续更新中。为了应对解读的挑战，该研究采用了QIAGEN全球领先的QIAGEN Clinical Insight Interpret（QCII）软件，筛选具有临床价值的体细胞突变，进行基于ACMG/AMP/CAP指南的Tier级别的分类，同时匹配相应的药物和临床试验信息。”

图3. QCII somatic解读结果

利用以上先进手段，研究者发现，ctDNA从获取血液样本到出具临床指导报告的平均周期为33天，肿瘤组织平均报告周期为30天（图4c）。基于UK NHS临床认可的19和24基因对应的变异位点在肿瘤组织和ctDNA中检测到的一致性达到了78.6%（图4d），考虑到基因Panel以及在肿瘤组织和ctDNA中检测灵敏度的差异，该一致性已经远高于其它研究。基于641个基因panel在肿瘤组织和ctDNA中检测到的突变位点一致性达到了74.5%，25.5%的差异最可能主要是来自生物学或临床因素的结果。例如，在一例结直肠癌患者ctDNA中检测到了KRAS c.34G>T(p.Gly12Cys)的突变，而该突变在肿瘤组织中没有发现，该突变位点很可能是患者采用抗EGFR突变药物帕尼单抗后产生的耐药突变。

图4. ctDNA分析报告周期和一致性评估结果

此外，研究者对入组的23名患者进行了拷贝数变异的分析（CNA），并将ctDNA分析获得的CNA 与基于Foundation One计算的CNA进行了比较。考虑到CNA检测需要样本中ctDNA含量比较高，将VAF设置为5%以后，肿瘤组织和ctDNA得到的拷贝数一致性可以达到73%。面对复杂的癌症和遗传病，越来越多的分析流程会进行CNA的分析。此外，QIAGEN Clinical Insight Interpret在2019年第一季度的更新中也加入了对CNA和融合基因的解读，并提供相关的分类级别评估、用药信息、预后以及影响的基因等信息。

图5. ctDNA CNA突变图谱热图

最终基于ctDNA突变图谱，在100位患者中，研究者在41位患者中找到了actionable alteration。QIAGEN Clinical Insight Interpret对11位患者匹配到了相应的治疗方案，17位患者获得了非匹配的治疗方案，13个患者由于不符合纳入标准、临床恶化、选择化疗方案等原因没有匹配到临床试验。

图6. 检测到的actionable alteration结果

TARGET项目前期100例患者的数据分析表明，ctDNA为同期的肿瘤组织提供了更加广泛的基因组信息，从而为患者的早期临床试验提供指导，这也为将血液基因组分析引入临床提供了实用模板。

参考文献：

1. Utility of ctDNA to support patient selection for early phase clinical trials: the TARGET study