由于当今社会不孕不育的现象越来越普遍，人们对辅助生殖的需求也越来越大。胚胎染色体数目异常在体外受精中较常发生，会引起植入失败或胎儿异常,是导致人类辅助生殖失败的一个重要原因。胚胎植入前进行染色体数目异常（非整倍体）筛查（PGT-A）可有效提高体外辅助生殖成功率，已被广泛应用于临床实践中。但由于该方法需要对将来发育为胎盘的滋养层（TE）进行活检,可能会使得胚胎受到创伤，进而导致植入成功率降低，而且胎儿出生后的安全性目前也还没有定论。

近年来，越来越多的研究关注于胚胎的嵌合性。嵌合性是指胚胎细胞中同时存在两种或多种不同染色体数目的现象。因为PGT-A只能检测TE细胞，而不是真正发育成胎儿的内细胞团（ICM）的染色体数目，所以经常产生假阳性和假阴性结果（图1）。植入假阴性的胚胎可能会造成植入失败或胎儿异常；而假阳性则可能会导致丢弃一个本可正常发育的胚胎。例如，已有研究报道，部分胚胎在植入前被误诊断为非整倍体或二倍体/非整倍体嵌合体，但最后分娩的宝宝是健康的。

图1. 基于TE活检的PGT-A因不能直接检测到ICM的染色体数目，会对于嵌合的胚胎得出假阳性或假阴性的结果。

鉴于TE活检存在诸多局限性，科学家将焦点转移到了一种非侵入性检测方法——无创胚胎植入前非整倍体基因检测（niPGT-A）（图2）。niPGT-A技术于2016年由陆思嘉、谢晓亮及合作者成功开发，通过检测人类体外受精的胚胎释放到培养液中的少量游离DNA（cfDNA）来判断胚胎的非整倍体情况。虽然该方法可以做到对胚胎无损伤，但在当时其假阴性和假阳性率上还是远高于基于TE活检的PGT-A。

6月24日，北京大学谢晓亮教授研究团队联合哈佛医学院Catherine Racowsky教授团队在PNAS上发表了niPGT-A的最新研究成果。该研究结果表明，niPGT-A可以达到假阴性为零，且其阳性预测值和特异性方面的表现均优于PGT-A。同时，niPGT-A检测胚胎倍性和染色体拷贝数的一致率比PGT-A更高。由于niPGT-A检测到的培养液中的cfDNA是来自于TE和ICM，这使得该方法不易产生与胚胎嵌合相关的错误，可比基于组织活检的PGT-A更可靠。

图2. 无创PGT-A（niPGT-A）: 一种不仅安全而且更准确的人类胚胎基因检测方法

谢晓亮和Catherine Racowsky研究团队对niPGT-A技术进行了优化，将其与TE活检PGT-A进行比较。该研究团队将捐赠的52个冷冻的人类囊胚期胚胎复苏后分别培养24小时后，然后收集胚胎培养液中的cfDNA，并进行NGS测序分析。这些囊胚此前已在其他实验室进行了基于TE活检的PGT-A检测。niPGT-A和PGT-A的检测结果都会与相应金标准——胚胎的测序结果进行比较，以评估检测的准确性。（图3）

图3. 研究分析工作流程

他们的研究结果显示，niPGT-A可以通过检测胚胎培养液中来自非整倍体细胞的DNA来查出异常胚胎。该研究团队采用了改进的全基因组扩增方法并且进行了算法上的改良，特别是通过对嵌合百分比为“M”的设定，以及对体现检测结果质量的变异系数（CV）的界定，提高了检测的准确性。为了系统检测分析胚胎嵌合性，研究团队找到了最佳的M阈值，超过这个阈值则可识别为非整倍体。当M阈值为60％时，假阴性率为0，假阳性率最低，区分非整倍体与整倍体胚胎效果最好（图4）。

图4. 在niPGT-A中通过假阴性和假阳性率的变化设定嵌合百分比M

方法改进后，该研究团队共确定了48个样本中的非整倍体情况（图5）。研究结果显示，通过严格去除卵冠丘细胞，niPGT-A的假阴性率为0，与基于TE活检的PGT-A相同。niPGT-A的假阳性率为20.0％，远低于PGT-A的50.0％。niPGT -A和PGT-A的阳性预测值分别为 91.7％和78.0％。在敏感性和阴性预测值方面，niPGT -A和TE活检PGT-A均为100％，特异性上niPGT-A为80％，高于TE活检PGT-A的50％。此外，niPGT-A拷贝数检测结果与胚胎检测结果一致性更高。

图5. niPGT-A与TE活检PGT-A比较

该研究表明，niPGT-A通过检测胚胎细胞释放到培养液中的DNA，不仅实现了无创的植入前筛查，而且为解决嵌合性胚胎的检测问题提供了可行的方法。利用改进过的全基因组扩增方法和设置嵌合性阈值进行降噪，niPGT-A可测出来自胚胎滋养层和内细胞团的非整倍性，且具有较高的敏感性和准确性。但相关研究成果还需要进一步临床结果的证实。虽然目前临床上仍采用传统的PGT-A作为体外受精的胚胎植入前染色体筛查的主要检测手段，但因其需要对TE进行细胞活检，对操作者的专业技能要求很高。该方法不仅是侵入性的，而且存在较高的假阴性和假阳性率。相比之下，niPGT-A或将成为一种更有潜力的未来检测方法。

运用胚胎非整倍体检测有助于提高辅助生殖治疗的着床率，是目前生殖医学临床上普遍应用的方法。最常用的是通过显微操作，在囊胚期获取几个滋养层细胞，进行全基因扩增分析检测，确定活检样本中的染色体数目，以此作为判定胚胎正常与否的依倨，提供临床胚胎移植参考。此方法的缺点是操作复杂，并对胚胎有一定的损伤。谢晓亮教授团队另辟蹊径，创造了一种全新的方法，抛弃常规活检方法，采取单个胚胎培养液，对培养液中的游离DNA进行全基因组扩增与分析。研究表明，培养液中的游离DNA也能提供足够的DNA，并能提供与活检相似，甚至更好更准确的结果。谢教授团队在世界顶级杂志PNAS发表的最新结果将大大推进该领域的研究与临床应用。

参考资料：

1. Huang, Lei; Bogale, Berhan; Tang, Yaqiong; Lu, Sijia; Xie, X. Sunney; Racowsky, Catherine "Non-invasive Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy (niPGT-A) in Spent Medium may be More Reliable than Trophectoderm Biopsy," Proc Natl Acad Sci USA online. DOI:10.1073/pnas.1907472116 (2019)

2. Xu, Juanjuan; Fang, Rui; Chen, Li; Chen, Daozhen; Xiao, Jian-Ping; Yang, Weimin; Wang, Honghua; Song, Xiaoqing; Ma, Ting; Bo, Shiping; Shi, Chong; Ren, Jun; Huang, Lei; Cai, Li-Yi; Yao, Bing; Xie, X Sunney; Lu, Sijia "Noninvasive chromosome screening of human embryos by genome sequencing of embryo culture medium for in vitro fertilization," Proc Natl Acad Sci USA 113(42), 11907-11912. DOI: 10.1073/pnas.1613294113 (2016)